فرآیند و کارکرد گیاهی

بررسی خصوصیات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی ژنوتیپ‌های منتخب جو وحشی
(Hordeum vulgare ssp. spontaneum) در سطوح مختلف تنش خشکی

معصومه گنجی¹، اسفندیار فرهمندفر²، مریم شهبازی^3* و مهدی زهراوی⁴

¹ گروه زراعت، اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، مازندران، ایران،

 ² اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، مازندران، ایران

³ بخش تحقیقات فیزیولوژی مولکولی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی،

کرج، ایران، ⁴ بانک ژن ملی گیاهی ایران، مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر، کرج، ایران

 (تاریخ دریافت: 04/05/93، تاریخ پذیرش نهایی: 20/03/1394)

چکیده:

خشکی یکی از مهم­ترین تنش­های غیرزنده است که رشد و نمو گیاهان را تحت تاثیر قرار می‎دهد. جو وحشی اسپانتانئوم (Hordeum vulgare ssp. spontaneum) والد جو زراعی است و دارای پتانسیل بالایی از لحاظ تحمل به تنش های محیطی می باشد. این بررسی بر روی 9 ژنوتیپ جو اسپانتانئوم برای تحمل به تنش­خشکی در آزمایشی بصورت کرت‌های خرد شده براساس طرح پایه بلوک‌های کامل تصادفی با سه تکرار در مزرعه در سال 91-1390، تحت شلتر انجام شد. کرت اصلی شامل سه تیمار آبیاری عبارت از بدون تنش، قطع آبیاری از مرحله گلدهی و تنش­خشکی بصورت عدم آبیاری و کرت فرعی بود نتایج نشان داد که اثر تنش­خشکی بر عملکرد دانه، بیوماس، محتوای نسبی آب برگ، تنظیم­اسمزی، هدایت روزنه‌ای، میزان کلروفیل کل،آنزیم­های آنتی­اکسیدانی، پروتئین، مالون دی‌آلدهید، قند محلول کل و پرولین معنی‌دار (P<0.01) بود واکنش ژنوتیپ­ها به خشکی از نظر صفات محتوای نسبی برگ، تنظیم­اسمزی، آنزیم­های آنتی­اکسیدانی، پروتئین، مالون دی­‌آلدهید، میزان کلروفیل کل و پرولین معنی‌دار (P<0.01) بود. نتایج بدست آمده از تجزیه به مولفه‌های اصلی براساس مجموع صفات مورد ارزیابی در شرایط تنش­خشکی، ژنوتیپ‌های مورد بررسی را در چهار گروه قرار داد. گروه اول و دوم شامل ژنوتیپ‌های 6،4 و 5 بود.ژنوتیپ‌های اخیردر شرایط خشکی به صورت معنی‌داری از عملکرد دانه، محتوای نسبی آب برگ، هدایت روزنه‌ای، میزان کلروفیل کل، فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز بالاتر و میزان مالون‌دی‌آلدهید و پتانسیل اسمزی پایین‌تر (منفی‌تر) برخوردار بودند، لذا به عنوان ژنوتیپ­های متحمل شناخته شدند.

کلمات کلیدی: آنزیم­های آنتی­اکسیدان، پروتئین، تنش­خشکی، جو اسپانتانئوم، مالون دی­آلدهید.

مقدمه:

تنش­های محیطی یکی از مهم­ترین عوامل کاهش­دهنده عملکرد دانه و تولید گیاهان زراعی به شمار می­روند از میان این تنش های غیر­زنده، تنش­خشکی تا­حد زیادی پیچیده­ترین تنش در مقیاس جهانی است که رشد و نمو گیاهان را تحت تاثیر قرار می‎دهد (Ceccarelli et al., 2008; Pennisi et al., 2010). عوامل ایجاد شرایط تنش، تعادل طبیعی را تغییر داده و منجر به یک سری تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی در گیاهان می‌شوند که تأثیر منفی بر رشد و تولید آنها دارد (Guo et al., 2010) که در نهایت منجربه کاهش میزان رشد و عملکرد نهایی محصول می‌شود
.(Guo et al., 2010; Ashraf, 2010) خشکی نه تنها روابط آبی گیاه را از طریق کاهش محتوای آب، کاهش فشار آماس و کاهش پتانسیل آبی کل تحت تاثیر قرار می‌دهد، بلکه موجب بسته شدن روزنه‌ها، کاهش محتوی نسبی آب برگ، محدودیت تبادل گازی، کاهش تعرق و کاهش جذب کربن (فتوسنتز) نیز می‌شود.(Guo et al, 2010)  در طی بروز تنش­خشکی گیاهان با ذخیره ترکیبات آلی کوچک مولکولی به عنوان تنظیم‌کننده‌های اسمزی همانند اسیدهای آمینه، قندها و تجمع برخی از یون‌های معدنی در واکوئل سعی در حفظ تعادل اسمزی و مقابله با تنش دارند (Ashraf, 2009; Chimenti et al., 2006). به عنوان پیامد تجمع این مواد، پتانسیل­اسمزی سلول کاهش می‌یابد و موجب جذب آب و نگهداری فشار تورژسانس سلول می‌شود (ابوالحسنی زراعتکار و همکاران، 1389). کربوهیدرات‌های محلول و سایر مواد محلول سازگار (مانند پرولین) به عنوان اسمولیت برای حفظ فشار ترگر سلول، حفظ یکپارچگی غشا و جلوگیری از دناتوره شدن پروتئین­ها استفاده می‌شود (Bartels and Sunkar, 2005; Kaplan and Guy, 2004; et al.,2006).

از سوی دیگر خشکی مانند سایر تنش‌های غیر­زیستی، موجب تولید بیش از حد گونه‌های فعال اکسیژن
Reactive Oxygen Species  (ROS) در گیاهان می‌شود. ROS می‌تواند به غشای سلولی، اسیدهای نوکلئیک، پروتئین­‌ها و کربوهیدرات‌ها آسیب وارد نماید (Ashraf, 2009; Gill and Tuteja, 2010) و باعث عدم تعادل متابولیک در گیاهان شود. ROS از رادیکال‌های آزاد و مولکول‌های غیر رادیکال (پراکسید هیدروژن، H₂O₂ و اکسیژن یگانه، O₂) تشکیل شده است (Munne-Bosch and Penuelas, 2003; Gill and Tuteja, 2010). گیاهان جهت مقابله با تنش اکسایشی ناشی از رادیکال‌های فعال اکسیژن دارای مکانیزم‌های ضد اکسایش آنزیمی (سوپر اکسید دیسموتاز، SOD؛ کاتالاز، CAT؛ آسکوربات پراکسیداز، APX؛ گلوتاتیون ردوکتاز، GR؛ مونو دهیدروآسکوربات ردوکتاز، MDHAR؛ دهیدروآسکوربات ردوکتاز، DHAR؛ گلوتاتیون پراکسیداز، GPX؛ گایاکول پراکسیداز، GOPX؛ گلوتانیون اس ترانسفراز، GST) و غیرآنزیمی (آسکوربیک اسید، ASH؛ گلوتاتیون، GSH؛ ترکیبات فنولی، آلکالوئید، آمینو اسیدهای غیر پروتئینی، و آلفا توکوفرول‌ها) می‌باشند  .(Gill and Tuteja, 2010)پژوهشگران نشان دادند که تحت تنش­خشکی فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدان در گندم (Khazaie and Borzooei, 2006) و جو (Ahmed, 2013) به طور معنی‌داری افزایش یافت.

تنوع ژنتیکی در جو زراعی به علت اصلاح آن به طور فزاینده­ای محدود شده است واین امر باعث ایجاد مشکل در سازش این گیاه با شرایط نامساعد محیطی از قبیل تنش­های زنده مانند بیماری­ها و تنش­های غیر­زیستی می­شود (زهراوی و همکاران، 1390). از آنجایی که خویشاوندان وحشی گیاهان زراعی پتانسیل بالایی از لحاظ تحمل به تنش­های زیستی وغیر زیستی را دارا هستند (Nevo and Chen, 2010) و جو اسپانتانئوم (Hordeum vulgare ssp spontaneum L.) به عنوان جد جوزراعی است که دارای خزانه ژنی غنی از نظر مقاومت در برابر تنش های محیطی زنده و غیرزنده بوده و از نظر تعداد کروموزوم مشابه جو زراعی می­باشد و هیچ مانع بیو­لوژیکی برای تلاقی بین این دو گونه وجود ندارد (Yan et al., 2011).

هدف از این تحقیق بررسی تنوع بین ژنوتیپ‌های منتخب جو وحشی در صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی دخیل در تحمل به خشکی و همچنین ارتباط بین این صفات و بیوماس و عملکرد دانه در شرایط تنش­خشکی به منظور دستیابی به منابع ژنتیکی جدید برای اصلاح ارقام زراعی جو می‌باشد. ژنوتیپ­های مورد بررسی در این پژوهش که واکنش متفاوتی به خشکی دارند براساس گزینش مقدماتی به منظور ارزیابی تحمل به خشکی در بین 100 نمونه جمع­آوری شده در کشور (زهراوی و همکاران، 1387؛ زهراوی، 1388) انتخاب شدند.

مواد و روش­ها:

این پژوهش به صورت کرت‌های خرد شده براساس طرح پایه بلوک­های کامل تصادفی در سه تکرار در مزرعه تحقیقاتی بانک ژن گیاهی ملی ایران واقع در کرج (51 درجه و 10 دقیقه طول شرقی و 35 درجه و 48 دقیقه عرض شمالی و ارتفاع

جدول 1- شماره ژنوتیپ­های جو وحشی اسپانتانئوم مورد مطالعه برای ارزیابی تحمل به تنش­خشکی

1321 متر از سطح دریا) در سال زراعی 91-1390 تحت شلتر اجرا شد. کرت اصلی شامل سه عامل عبارت از 1) بدون اعمال تنش­خشکی (شاهد) 2) قطع آبیاری از مرحله گلدهی تا پایان فصل­رشد (تنش متوسط) 3) تنش­خشکی بصورت عدم آبیاری (فقط یکبار انجام آبیاری در حد استقرار گیاه) (تنش شدید) و تعداد 9 (ژنوتیپ) جو وحشی اسپانتانئوم (جدول 1) به عنوان عامل فرعی منظور شد. هر نمونه‌ ژنوتیپی بر روی سه ردیف کشت شد. هر ردیف به طول دو متر و فاصله 60 سانتی‌متر بین ردیف‌ها در نظر گرفته شد.

نمونه برداری‌ها و اندازه­گیری‌ها: نمونه برداری­ها جهت بررسی صفات فیزیولوژی و بیوشیمیایی در آزمایش­های شاهد، قطع آبیاری از گلدهی در20روز پس از گلدهی زمانی که در صد رطوبت خاک در شرایط شاهد 19/17 درصد، در تنش متوسط 08/8 در تنش شدید به 82/6 رسید صورت گرفت.

عملکرد دانه و بیوماس: در زمان برداشت از سطح کل کرت بصورت کف بر از سطح خاک، از هر یک از واحدهای آزمایشی شد و پس از خشک شدن کامل و توزین گیاهان برداشت شده، بیوماس و عملکرد دانه هر کرت (2/1 متر مربع) بدست آمد.

محتوای نسبی آب برگ (RWC): محتوای نسبی آب برگ پرچم، با استفاده از معادله (1) محاسبه شد .(Pask et al., 2012)

معادله (1)             %RWC= (FW-DW/TW-DW)* 100

وزن نمونه­های خشک (DW)،وزن آماسی (TW)، وزن تر برگ (FW)

هدایت روزنه­ای: به منظور ارزیابی میزان هدایت روزنه­‌ای، از هر کرت 10 بوته به صورت تصادفی انتخاب و میزان هدایت روزنه­‌ای برگ پرچم در ساعت 10-9 صبح توسط دستگاه  POROMETERمدل AP4- DELTA- T DEVICES اندازه­گیری و میانگین اعداد بر اساس میلی­مول بر متر­مربع در ثانیه (mmol m^-2 s^-1) برای هر کرت ثبت گردید.

تنظیم­اسمزی: برای محاسبه مقدار تنظیم­اسمزی کل در گیاه از اختلاف پتانسیل­اسمزی برگ­‏های گیاهان شاهد و تحت تنش در شرایط آماس کامل استفاده گردید. بدین ترتیب که برگ پرچم هر بوته شامل گیاهان تحت تنش و گیاهان شاهد در مرحله 20 روز پس از گلدهی، به مدت 24 ساعت در آب مقطر با دمای چهار درجه سانتی‏گراد در شرایط تاریکی غوطه­ور گردید تا همه برگ­‏ها به آماس برسند. سپس با استفاده از دستگاه اسمومتر مقدار پتانسیل­اسمزی برگ­‏ها محاسبه شد. از اختلاف مقدار پتانسیل­اسمزی برگ تحت تنش با برگ شاهد، مقدار تنظیم­اسمزی کل طبق رابطه ذیل بدست آمد (Blum, 1989).

معادله (2 )                             OA_tot = &psi;S_c100 – &psi;S_s100

در این معادله OA_tot مقدار تنظیم­اسمزی کل، &psi;S_c100 مقدار پتانسیل­اسمزی گیاه شاهد در آماس کامل، &psi;S_s100 مقدار پتانسیل­اسمزی گیاه تحت تنش در صد در صد آماس می باشد.

میزان پرولین و قند محلول کل: اندازه­گیری میزان پرولین با استفاده از روش Bates و همکاران (1973) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 اندازه‌گیری شد. برای اندازه‌گیری میزان قند از روش تغییر یافته فنل و اسید سولفوریک (AOAC، 1995) استفاده شد. ابتدا بر روی مقدار 02/0 گرم ماده خشک برگ،5/1 میلی­لیتری از اتانول 80% با دمای 70 درجه سانتیگراد اضافه شد و پس از تکان دادن شدید نمونه­ها با 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و پس از آن محلول شناور رویی را، به فالکون 15 میلی­لیتری منتقل شد. این مرحله و شستشوی رسوب سه بار تکرار شده و سپس محلول داخل فالکون در آون 45 درجه سانتیگراد به طور کامل تبخیر شد و رسوب باقیمانده برای اندازه­‌گیری قند محلول کل و جزء مورد استفاده قرار گرفت. برای اندازه­گیری قند کل به رسوب داخل فالکون آب مقطر اضافه شد و پس از حل شدن کامل آن، اسید سولفوریک 98% و فنل 10% به آن اضافه گردید و پس از 45 دقیقه میزان قند کل توسط Spectrophotometer Infinite M200 PRO- TECAN در طول موج 485 نانومتر بررسی گردید.

اندازه گیری میزان کلروفیل و غلظت مالون دی­آلدهید: کلروفیل برگ با استفاده از استون 80% استخراج گردید و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر میزان جذب را در چهار طول موجnm 510 ، nm480، nm646 و nm663 قرائت گردید و میزان رنگیزه­های موجود به روش  Arnon(1949) محاسبه شد.

به منظور اندازه­گیری غلظت مالون دی­آلدهید توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد. غلظت مالون دی­آلدهید با استفاده از معادله (3) محاسبه گردید Heath and Packer, 1969)):

معادله (3) MDA(nmol/ml) =[(A₅₃₂ – A₆₀₀)/ 157000] 10⁶

در این معادله MDA مالون دی­آلدهید بر حسب mL^-1nmol.، جذب در طول موج­های ₅₃₂A و ₆₀₀Aمی­باشد

اندازه­گیری پروتئین و آنزیم­های آنتی­اکسیدانی: میزان پروتئین محلول­کل طبق روش  Bradford(1979) با استفاده از عصاره استخراج شده توسط بافر اندازه­گیری شد و در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Cary 300) UV-Visible spectrophotometer قرائت گردید.

اندازه­گیری فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Aebi (1984) در طول موج 240 نانومتر، میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز طبق روش Nakanoو Asada (1978) در طول موج 290 نانومتر، فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس روش Chance و Maehly (1955) در طول موج 470 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه بر حسب جذب در دقیقه(Abs/min)  به وسیله دستگاه (Cary 300) UV-Visible Spectrophotometer ترسیم شد.

تجزیه و تحلیل داده­ها: داده‌های حاصل از آزمایش با نرم‌افزار (Ver 9.1) SAS مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت، میانگین داده‌ها با آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد مقایسه شد و نمودارهای لازم با نرم‌افزار Excel رسم گردید. همچنین پس از استاندارد کردن داده­های مربوط به صفات مورد نظر و عملکرد دانه در شرایط تنش و بدون تنش، تجزیه به مؤلفه­های اصلی (Principal Component Analysis) انجام شد و نمودار بای­پلات آن­ها بااستفاده از نرم­افزار
 (ver 9.1) SAS ترسیم گردید.

نتایج و بحث:

عملکرد دانه و بیوماس: با توجه به نتایج به دست آمده اثر ژنوتیپ و تنش برای صفت و بیوماس و همچنین واکنش ژنوتیپ­ها در سطوح مختلف خشکی اعمال شده معنی­دار (P<0.01) بود و همچنین اثر تنش و ژنوتیپ نیز بر عملکرد دانه معنی­دار (P<0.01) بود (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). با افزایش سطح تنش­خشکی بیوماس در ژنوتیپ­ها کاهش پیدا کرد (جدول 2) که بیشترین بیوماس در شرایط تنش شدید مربوط به ژنوتیپ 4 به میزان 481 گرم و کمترین بیوماس در شرایط تنش شدید مربوط به ژنوتیپ 9 به میزان 282 گرم بود (جدول 3). در بررسی صفت عملکرد دانه ژنوتیپ 6 ،5 و 4 دارای بیشترین عملکرد بودند (جدول 3). محققین بسیاری کاهش عملکرد دانه گندم و جو را در شرایط تنش­خشکی گزارش کرده اند (Sio-Se Mardeh, 2006). تولید ماده خشک در گیاهان یکی از مهمترین عوامل تاثیر گذار روی عملکرد می باشد. محققان زیادی پیشرفت عملکرد را در طی سال­های اخیر به دلیل افزایش ماده خشک گیاه دانسته اند. به عبارتی دیگر ارقامی از جوکه هم دارای عملکرد بیولوژیک بالا و هم دارای شاخص برداشت بالا بودند به احتمال زیاد دارای عملکرد بالا خواهند بود (Reynolds and Tuberosa, 2008). با توجه به تاثیر خشکی بر بیوماس، احتمالا اجزای عملکرد مورد تاثیر قرار گرفته و در نتیجه منجر به کاهش معنی­دار عملکرد دانه شده است. نتایج بدست آمده در این آزمایش با نتایج ارزیابی­‌های مقدماتی انجام شده توسط زهراوی و همکاران (1387) برروی 100 اکوتیپ جو وحشی اسپانتانئوم جمع­آوری شده از مناطق مختلف کشور مطابقت داشت.

محتوای نسبی آب برگ و هدایت روزنه­ای: اولین پاسخ

جدول 2- مقایسه تنظیم اسمزی نه ژنوتیپ منتخب جو وحشی اسپانتانئوم در دو سطح تنش­خشکی ملایم وتنش­خشکی شدید

جدول 3- مقایسه صفات مورد بررسی در سطوح تنش آبی و شاهد در نه ژنوتیپ منتخب جو اسپانتانئوم در مزرعه

همه گیاهان به کمبود آب، بستن روزنه­ها جهت کاهش اتلاف آب از طریق تعرق می­باشد محتوای نسبی آب برگ میزان کمبود آب را نشان می‌دهد و ممکن است شاخصی برای نشان دادن شدت تنش­خشکی باشد (Pask et al., 2012). در این بررسی اعمال تیمارهای قطع آبیاری سبب کاهش معنی­دار (P<0.01) محتوای نسبی آب برگ و هدایت روزنه­ای در مقایسه با تیمار شاهد شد (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). همچنین واکنش ژنوتیپ­ها در سطوح مختلف خشکی اعمال شده از نظرRWC معنی­دار (P<0.01) بود (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده) با توجه به اختلاف زیاد بین سطوح تنش تجزیه واریانس صفت هدایت روزنه­ای به صورت جداگانه از روش برش‌­دهی فیزیکی  (Physical Slicing)صورت پذیرفت و نتایج نشان داد اختلاف ژنوتیپ­ها در تنش متوسط (قطع آبیاری بعد از گلدهی) معنی­دار (P<0.01) است (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). با توجه به نتایج حاصل از مقایسه میانگین ژنوتیپ­‌ها این صفت ژنوتیپ 4، 5 و 6با میزان 192، 2/182 و 6/179 میلی­مول بر متر­مربع در ثانیه به صورت معنی­داری دارای بیشترین هدایت روزنه­ای بودند همچنین در بررسی میزان  RWCنتایج بیانگر این موضوع است که ژنوتیپ 6 در مقایسه با سایر ژنوتیپ­ها در شرایط تنش دارای محتوای رطوبت نسبی بیشتر است (جدول 3، شکل 1-a). هر چند که کاهش میزان RWC در شرایط تنش در اکثر مطالعات اشاره شده است اما به طور معمول، ژنوتیپ­‌هایی که RWC بالاتری در شرایط تنش­خشکی دارند، ژنوتیپ­‌های متحمل‌تری خواهند بود (Pask et al., 2012; Eppel et al., 2013). همچنین Eppel و همکاران (2013) در ارقام جو گزارش کردند تنش­خشکی آخر فصل، محتوای نسبی آب برگ و هدایت روزنه­‌ای ارقام جو را به طور معنی­‌دار کاهش داده است.

تنظیم­اسمزی و متابولیت­های سازگار: تنظیم­اسمزی یکی از مولفه­های اصلی فیزیولوژیکی در گیاهان در پاسخ به تنش­خشکی است (Niknam and Turner, 2003). تنظیم­اسمزی در تیمار تنش شدید در تمامی ژنوتیپ­های مورد بررسی به جزء ژنوتیپ­های 3 و 8 پس از اعمال تنش روند افزایشی داشته و بین ژنوتیپ­های 5، 4 و 6 به ترتیب بالاترین تنظیم را نسبت به ژنوتیپ­های دیگر از خود نشان داد که می­تواند نشان­دهنده برتری این ژنوتیپ­های در تحمل به تنش­خشکی باشد (جدول4) (لازم به ذکر است که صفت تنظیم­اسمزی از تفاضل تنظیم­اسمزی در شرایط تنش وشاهد است در نتیجه تنها یک سری داده که مربوط به تنظیم­اسمزی در شرایط تنش است مورد ارزیابی قرار گرفته میشود). افزایش مواد اسمزی به دو صورت، افزایش جذب مواد معدنی به ویژه پتاسیم و تجزیه ترکیب­های بزرگ مانند نشاسته و یا سنتز ترکیبات آلی مانند

شکل 1-بررسی صفات بیوماس، درصد محتوای نسی رطوبت، میزان کلروفیل کل، پرولین در ژنوتیپ­های منتخب جو وحشی در سطوح مختلف تنش خشکی

برخی اسید­های آمینه به ویژه پرولین امکان پذیر است. بنابراین در شرایط تنش به طور معمول غلظت قند­ها به خصوص گلوکز، پرولین افزایش می یابد و آنچه که مهم است و باید به آن توجه شود مقدار انرژی است که در ارتباط با این پدیده به جای بهبود رشد و افزایش عملکرد باید هزینه گردد.

نتایج بدست آمده نشان داد که اثر ژنوتیپ و تنش­خشکی برای قند­های محلول کل و پرولین (P<0.01) معنی­دار شد در حالیکه واکنش ژنوتیپ­ها در سطوح مختلف خشکی اعمال شده برای قند­های محلول کل معنی­دار نشد ولی در پرولین معنی­دار (P<0.01) بود (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). طبق نتایج بدست آمده از مقایسه میانگین ژنوتیپ­ها، ژنوتیپ 6 و پس از آن ژنوتیپ­های 4 و 5 بیشترین میزان قند محلول و ژنوتیپ 7 کمترین میزان را به خود اختصاص داده است (جدول5). ژنوتیپ­های دیگر افزایش متوسطی در میزان کربوهیدرات­های خود داشتند. با افزایش شدت تنش میزان غلظت قند­های محلول در ژنوتیپ متحمل به خشکی سریعاً افزایش یافت، که این امر می تواند نقش قند­های محلول را در تنظیم­اسمزی در گیاه نشان دهد. می توان استدلال کرد که

جدول4- مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در سطوح تنش آبی و شاهد در نه ژنوتیپ منتخب جو اسپانتانئوم در مزرعه

در هر ستون میانگین­های دارای حروف مشترک، براساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح 5 درصد تفاوت معنی­داری ندارند.

انباشت قند­های محلول در شرایط تنش، علاوه بر نقش­های فیزیولوژیکی مهمی که از نظر تامین انرژی و جلوگیری از مرگ حتمی ایفا می کند، می­توانند باعث کاهش پتانسیل­اسمزی سلول شده و از طریق تنظیم­اسمزی موجب بالاتر نگه داشتن میزان آب نسبی در ژنوتیپ متحمل به خشکی شده و به این ترتیب در سازوکار تحمل به خشکی نقش مهمی داشته باشند.

نتایج حاصل از اندازه­گیری میزان پرولین نیز نشان می­دهد که این صفت پس از اعمال تنش روند افزایشی داشت (شکل 1-b). نتایج نشان می دهد در بین ژنوتیپ­ها ژنوتیپ 6نیز و پس از آن ژنوتیپ­های 5 و 4 بیشترین غلظت اسید آمینه پرولین را دارا بودند به طوری که میزان آن پس از اعمال تنش شدید به ترتیب8/5، 09/5 و 8/4 میکرو­مول بر گرم وزن تر بود، این در حالی است که ژنوتیپ 9 با میزان 5/2 میکرو­مول بر گرم وزن تر کمترین میزان پرولین را دارا بود (جدول5). تجمع اسیدهای آمینه در بسیاری از مطالعات انجام شده بر روی گیاهان در معرض تنش غیرزنده مشاهده شده است ((Lugan et al., 2010; Sánchezetal, 2008. می­توان نتیجه گرفت که انباشت این ترکیبات نقش مؤثری در تنظیم اسمزی داشته و از طریق کاهش سمیت مواد، حفاظت سیستم غشایی سلول در مقابل تنش را فراهم ساخته است، در نتیجه قابلیت انطباق با شرایط خشک برای ژنوتیپ متحمل فراهم گردیده است.

میزان کلروفیل کل و مالون دی‌آلدهید (MDA): بررسی اثر تنش­خشکی بر میزان کلروفیل کل و تغییرات (MDA) در طول دوره اعمال تنش نشان داد که اختلاف معنی­داری (P<0.01) در هر سطح تنش­خشکی و بین ژنوتیپ­ها و اثر متقابل آنها وجود داشت (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده).

در این بررسی اعمال تیمارهای تنش­خشکی سبب کاهش معنی­دار میزان کلروفیل کل شد (شکل1-c). با توجه به نتایج حاصل از مقایسه میانگین این صفت در تیمارهای مورد بررسی ژنوتیپ 6 ،5 و 4 به ترتیب با میزان 05/1، 90/0 و 90/0 میلی گرم بر میلی­لیتر به صورت معنی­داری دارای بیشترین میزان کلروفیل کل بودند (جدول5). نتایج بدست آمده در ارتباط با کاهش کلروفیل تحت تنش توسط سایر محققین نیز گزارش شده است (Li et al., 2011). از جمله دلایلی که برای کاهش کلروفیل در شرایط تنش خشکی عنوان شده‌ است می‌توان به تخریب غشاهای تیلاکوئید کلروپلاست و اکسیداسیون نوری کلروفیل در اثر گونه‌های فعال اکسیژن(Reddy et al., 2004)  و افزایش فعالیت آنزیم کلروفیلاز اشاره کرد (Ranjan et al., 2001). در این بررسی اعمال تیمارهای تنش­خشکی بر صفت

MDA نتایج نشان داد که در بین ژنوتیپ­ها با افزایش سطح تنش میزان MDA افزایش داشته که ژنوتیپ 8 با 13/4 نانومول بر میلی­لیتر از نظر مالون دی­آلدهید بیشترین میزان را در شرایط تنش شدید داشت و همچنین ژنوتیپ 6 با 58/3 نانومول بر میلی­لیتر کمترین میزان را در شراط تنش شدید داشت که ژنوتیپ 8 نسبت به شرایط شاهد 38 درصد و ژنوتیپ 6، 17 درصد افزایش رو از خود نشان دادند (شکل 2-a، جدول 5). افزایش متوسط  MDAدر تنش متوسط نشان دهنده وقوع استرس اکسیداتیو متوسط است. درمقابل، تحت شرایط تنش شدید، میزان  MDAافزایش معنی­داری را بخصوص در ارقام حساس نشان داد، که نشاندهنده کاهش فعالیت آنزیم­های آنت­ اکسیدانی می­باشد و این نتیجه می تواند نشان دهنده آن باشد که تحت شرایط تنش متوسط، رادیکال­ها به طور مؤثر توسط سیستم دفاع آنتی­اکسیدانی هضم می­شوند و در دوره­هایی از استرس شدیدتر، سیستم هضم کننده با افزایش سرعت ولی در رادیکال­ها اشباع شده و در نتیجه به سلول آسیب می­رسد. محققان زیادی افزایش مالون دی­آلدهید را در گیاهان مختلف در تنش­خشکی گزارش کرده­اند از جمله: Anjum و همکاران (2011) در مطالعه تنش­خشکی در سویا و Ahmed و همکاران (2013) در جو.

پروتئین و آنزیم­های آنتی­اکسیدانی: بررسی تغییرات آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و پروتئین در طول دوره اعمال تنش­خشکی نشان داد که اثر خشکی اثر ژنوتیپ و واکنش ژنوتیپ­ها در سطوح مختلف خشکی اعمال شده بر این صفات معنی­دار (P<0.01) بود (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). بررسی­ها نشان داده است که پاسخ محتوای پروتئین برگ به تنش و خشکی متغیر بوده و می­تواند افزایشی، کاهشی یا بدون تغییر باشد. که در این تحقیق تمامی ژنوتیپ­ها پس از اعمال تنش روند کاهشی را نشان دادند (جدول 51). کاهش چشمگیر غلظت پروتئین محلول برگ در شرایط تنش­خشکی شدید کاملاً محسوس است که این امر می تواند به کاهش زیر واحدهای روبیسکو و افزایش در اکسیداسیون پروتئین مرتبط می­باشد (Tahkokorpi, 2010). فعالیت بسیاری ازآنزیم­های آنتی­اکسیدان در واکنش به تنش­خشکی افزایش می­یابد. هرچند واکنش آنزیم کاتالاز در شرایط تنش­خشکی متغیر بوده و می­تواند افزایشی، کاهشی یا بدون تغییر باشد (Sairam and Srivastava,2001). نتایج این آزمایش روند افزایشی آنزیم­های آنتی­اکسیدانی را در ژنوتیپ­های مورد آزمایش نشان داد (شکل2-b، 2-c، 2-d)، پس از اعمال تنش ژنوتیپ­های 6 و 5 بیشترین غلظت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی را دارا بودند (شکل2-b، 2-c، 2-d، جدول 5). در تحقیقات گذشته نیز افزایش کاتالاز را در گیاهان مختلف در تنش­خشکی گزارش شده است (Yang and Miao, 2010 and Panda, 2008) همچنین در مطالعات گذشته نیز افزایش آسکوربات پراکسیداز در تنش­خشکی را نیز گزارش کردند (Selote and Chopra, 2010).

گیاهان به منظور مقابله با خسارات گونه­های فعال اکسیژن در شرایط تنش­خشکی، نیاز به یک سیستم آنتی­اکسیدان فعال دارند. بسیاری از مطالعات نشان داده­ است که یک سیستم آنتی اکسیداتیو کارآمد به همراه افزایش قند­های محلول، و تجمع پرولین در گیاه می­تواند نقش مهمی در تحمل به خشکی ایفا کند (Li et al., 2006).

بررسی همبستگی بیوماس و عملکرد دانه با صفات فیزیولوژی و بیوشیمیایی: به منظور بررسی ارتباط صفات بیوشیمیایی و فیزیولوژی باهم و با بیوماس و عملکرد دانه ضرایب همبستگی ساده (پیرسون) انجام شد (جدول همبستگی ارائه نشده است). با توجه به نتایج، عملکرد دانه و بیوماس همبستگی مثبت و معنی­داری (P<0.05) با صفات محتوای نسبی آب برگ (40/0=r)، میزان کلروفیل کل (31/0=r)، هدایت روزنه­ای برگ (51/0=r) و با نشان داد. همچنین بین محتوای نسبی آب برگ و هدایت روزنه­ای همبستگی مثبت و معنی­داری (P<0.01) دیده شد که بیانگر این است که گیاه با باز نگه داشتن روزنه، خنک نگه داشتن برگ و افزایش تبادلات گازی باعث افزایش کارایی فتوسنتز نهایتا موجب عملکرد بالاتر شده است (Reynolds and Tuberosa, 2008) نتایج این تحقیق با یافته­‌های زارعی (1388) و علیپور (1386) مطابقت نشان داد. همچنین در بررسی نتایج همبستگی صفات

شکل2–بررسی صفات مالون دی آلدهید و آنزیم های آنتی اکسیدانی در ژنوتیپ های منتخب جو وحشی در سطوح مختلف تنش خشکی

فیزیولوژیکی نشان دادکه گیاه در شرایط تنش با کاهش پتانسیل اسمزی و افزایش قدرت جذب آب، محتوای نسبی آب برگ را در سطح بالا نگه داشته اشت. در شرایطی که محتوای آبی برگ پایین باشد، سلول‌­ها به آماس کامل نمی‌رسند و در نتیجه اختلال در سیستم آنزیمی گیاه و به تبع آن کاهش فتوسنتز اتفاق می‌افتد (Reynolds and Tuberosa, 2008).

مطالعه همبستگی صفات نشان داد که عملکرد دانه با میزان آنزیم آسکوربات پراکسیداز (35/0 =r)، آنزیم پراکسیداز (29/0 =r) و آنزیم کاتالاز (29/0 =r) همبستگی مثبت معنی­‌دار و با میزان مالون دی­آلدهید (47/0- =r) همبستگی منفی معنی­داری (P<0.01) داشت که نشان دهنده کاهش عملکرد دانه در صورت تخریب گیاه ناشی از تنش­خشکی است. به طور کلی می توان این گونه نتیجه­گیری کرد که میزان فعالیت آنزیم­های پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در ژنوتیپ­های متحمل بیشتر از ژنوتیپ­های حساس بود در نتیجه توسط این مکانیسم به خوبی با رادیکال­های اکسیژن آزاد تولید شده در اثر تنش­خشکی مقابله کردند و پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی و متعاقبا میزان مالون دی­آلدهید نسبت به ژنوتیپ­های حساس به مراتب کمتر بود که احتمالا می­تواند توجیه کننده کاهش کمتر عملکرد دانه در شرایط تنش نسبت به ژنوتیپ­های حساس باشد. همچنین در بین صفات تنظیم­اسمزی همبستگی بالا مثبت و معنی­داری (P<0.01) با پرولین (52/0 =r) و قند محلول کل (54/0=r).

تجزیه به مؤلفه­های اصلی در صفات فیزیولوژی و بیوشیمیایی: نتایج تجزیه به مؤلفه­های اصلی برای شرایط تنش­خشکی ملایم و شدید نشان داد که صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی ارزیابی شده، در قالب دو مؤلفه اصلی مشتمل بر 92/84 درصد از تغییرات، قابل بیان می­باشند (جدول 6).

نمودار بای­پلات براساس دو مؤلفه اصلی اول ترسیم گردید (شکل 3). براین اساس، ژنوتیپ­ها به چهار گروه تقسیم شدند. گروه اول شامل ژنوتیپ 6 بود. این ژنوتیپ بیشترین مقدار عددی مؤلفه اصلی را داشت. با توجه به اینکه در این مؤلفه اصلی، صفات عملکرد­دانه، بیوماس، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی، تنظیم­اسمزی و اسمولیت­هایی مانند پرولین و قندهای محلول دارای ضریب مثبت بزرگ و صفات مالون دی‌­آلدهید و پراکسیداسیون لیپید دارای ضریب منفی کوچک بودند، این ژنوتیپ به عنوان نمونه متحمل با عملکرد بالاتر و صفات مطلوب در شرایط تنش­خشکی شناسایی شد. گروه دوم ژنوتیپ­های 5 و 4 در برداشـت. این ژنوتیپ­ها دارای مقادیر بالا از لحاظ هر دو مؤلفه اصلی اول و دوم بودند، لذا این ژنوتیپ­ها نیز به عنوان نمونه­های متحمل شناسایی شدند. براساس این نتایج، سه ژنوتیپ 6، 5و 4 به عنوان ژنوتیپ­های برتر متحمل به تنش­خشکی در این تحقیق، مشخص گردیدند. فعالیت آنتی­اکسیدانی بیشتر و مالون دی­آلدهید کمتر (شکل 2) در ژنوتیپ 6 سبب شده است که این ژنوتیپ در گروه مجزایی از دو ژنوتیپ 4 و 5 قرار گیرد.

گروه سوم شامل ژنوتیپ 1 می­باشد. این ژنوتیپ از لحاظ مؤلفه اصلی اول مقدار نزدیک به صفر داشت. به عبارت دیگر ژنوتیپ 1 از لحاظ صفات عملکردی (عملکرد دانه و بیوماس) از وضعیت متوسطی برخوردار بود. اما این ژنوتیپ از لحاظ مؤلفه اصلی دوم دارای مقدار بالایی بود. این خصوصیت سبب شد که ژنوتیپ 1در نمودار بای­پلات مؤلفه­های اصلی در گروه متمایزی قرار گیرد. این ژنوتیپ دارای پائین­ترین میزان شاخص تحمل Tolerance Index)) بود، به عبارتی کاهش عملکرد در این ژنوتیپ نسبت به سایر ژنوتیپ­ها از میزان کمتری برخوردار بود، هرچند که عملکرد بالقوه در این ژنوتیپ بالا نبود (اطلاعات منتتشر نشده). همچنین ژنوتیپ 1 دارای تنظیم­اسمزی مطلوب و مالون دی­‌آلدهید و فعالیت آنزیمی متوسط بود (شکل2). لذا می­توان نتیجه گرفت که این ژنوتیپ از لحاظ صفات مرتبط با تحمل به تنش­خشکی در وضعیت متوسطی بود و از اینرو به عنوان ژنوتیپ نیمه متحمل قابل شناسایی می­باشد.

ژنوتیپ­های گروه چهارم دارای مقادیر کمتری از لحاظ هر دو مؤلفه اصلی بودند و به عنوان ژنوتیپ­های حساس شناسایی می­شوند. ژنوتیپ­های 8، 9،7 و2 بطور مشخص دارای سطح فعالیت آنتی­اکسیدانی پائین­تر و مالون دی‌­آلدهید بالاتر بودند.

جدول 6- نتایج تجزیه به مؤلفه­های اصلی صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در نه ژنوتیپ منتخب جو وحشی اسپانتانئوم  تحت تنش­خشکی ملایم و شدید

.

شکل 3- نموار بای­پلات مبتنی بر مؤلفه­های اصلی برای صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در نه ژنوتیپ منتخب جو وحشی اسپانتانئوم تحت تنش­خشکی ملایم و شدید

ژنوتیپ 3 نسبت به سایر ژنوتیپ­های این گروه هدایت روزنه­ای پائین­تری داشت و از این رو به عنوان یک زیر گروه مجزا قابل تمایز می­باشد.

نتیجه­گیری کلی:

نتایج این بررسی نشان داد ژنوتیپ‌­های 4،5 و 6 در هر دو شرایط تنش و در شرایط شاهد از آب به صورت مقتصدانه استفاده می‌کنند و این موضوع با محتوای نسبی آب بیشتر و هدایت روزنه‌­ای پایین در هر دو شرایط تنش و بدون تنش قابل مشاهده است. همچنین این ژنوتیپ­ها پتانسیل اسمزی پایین و محتوای پرولین بالاتر و در نهایت از مکانیسم تنظیم اسمزی مطلوبی برخوردارند. از آنجایی که ژنوتیپ­های 4 و 5 افزایش چشمگیری نسبت به سایر ژنوتیپ­‌ها در میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی­اکسیدانت از خود نشان دادند لذا این احتمال وجود دارد که در این ژنوتیپ­‌ها، فعالیت آنزیم‌­های آنتی اکسیدان در مهار اکسیژن‌­های فعال نقش مهمی ایفا کرده است. محتوای کلروفیل بالاتر به ویژه در دو ژنوتیپ نیز بیانگر حفظ بهتر ساختار سلول، عملکرد مطلوب فتوسنتز و در نهایت تولید

ماده خشک در این ژنوتیپ‌ها می‌باشد. در مقابل ژنوتیپ­های 8، 9،7 و2 بطور مشخص دارای سطح فعالیت آنتی اکسیدانی پائین­تر و مالون دی­‌آلدهید بالاتر بودند. براساس نتایج بدست آمده در مورد عملکرد دانه، بیوماس و صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مورد بررسی، ژنوتیپ­ها از نظر تحمل به خشکی در 4 دسته متحمل تا حساس تقسیم بندی شدند.

سپاسگزاری:

بدین وسیله از پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران و به ویژه بخش تحقیقات فیزیولوژی مولکولی به دلیل فراهم آوردن امکانات مورد نیاز تشکر و قدردانی می گردد.

منابع:

ابوالحسنی زراعتکار، م.، لکزیان، ا.، غلامحسین پور جعفری، ا. و اخگر، ع. ر. (1389) تأثیر تنش­خشکی بر سیستم تثبیت نیتروژن باکتری Sinorhizobium و انباشت متابولیت‌های سازگار در گیاه یونجه  (Medicago sativa sp.)رقم بمی. مجله آب و خاک 24 (3) صفحات 407- 416.

زارعی، س. (1388) ارزیابی و بررسی تنوع ژنتیکی صفات زراعی و مرفو- فیزیولوژیک مرتبط با تحمل به تنش خشکی در گندم‌های بومی ایران. پایان نامه کارشناسی ارشد. رشته اصلاح نباتات. دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران.

زهراوی، م. (1388) ارزیابی ژنوتیپ­های جواسپانتانئوم (Hordeum spontaneum) از نظر شاخص­های تحمل به خشکی مجله به نژادی نهال و بذر 1-25 صفحات 549-533.

زهراوی، م.، تقی نژاد، ا.، افضلی فر، ا.، بی همتا، م.، مظفری، ج وشفاءالدین، س. (1390) ارزیابی تنوع ژنتیکی صفات آگرومورفولوژیکی در ژرم­پلاسم جو اسپانتانئوم ایران. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات ژنتیک واصلاح گیاهان مرتعی وجنگلی ایران 1-19 صفحات 70-55.

علیپور، م. (1386) مطالعه برخی صفات نموی و فیزیولوژیکی مرتبط با تحمل به خشکی لاین‌های امید بخش گندم زمستانه درتاریخ‌های مختلف کاشت. پایان نامه کارشناسی ارشد. رشته زراعت. دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج.

Aebi, H. E. (1984) Catalase in vitro. Method in Enzymology 105: 121-126.

Ahmed, I. M. H., Dai, W., Zheng, F., Cao, G., Zhang, D. and Sun, F. Wu. (2013) Genotypic differences in physiological characteristics in the tolerance to drought and salinity combined stress between Tibetan wild and cultivated barley. Plant Physiology and Biochemistry, 63: 49-60.

Anjum, S. A., Wang, L., Farooq, M. and Khan and L. Xue, I. (2011) Methyl Jasmonate-Induced Alteration in Lipid Peroxidation. Journal of Agronomy and Crop Science, 197: 296–301.

Arnon, D. I. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology, 24: 1-15.

Ashraf, M. (2009) Biotechnological approach of improving plant salt tolerance using antioxidants as markers. Biotechnology Advances, 27: 84–93.

Ashraf, M. (2010) Inducing drought tolerance in plants: Recent advances.Biotechnol. Advance 28: 169–183.

Bartels, D. and Sunkar, R. (2005) Drought and salt tolerance in plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 24: 23–58.

Bates, L. S., Waldren, R. P. and Teare, I. D. (1973) Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39: 205-207.

Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254.

Ceccarelli, S. (2010) Drought and drought resistance. Encyclopedia of biotechnology in agriculture and Food 1: 205–207.

Chance, B., and Maehly, A. (1955) Assay of catalase and peroxidase. Methods Enzymology 2: 764-817.

Chimenti, C. A., Marcantonio, M. and Hall, A.J. (2006) Divergent selection for osmotic adjustment results in improved drought tolerance in maize (Zea mays L.) in both early growth and flowering phases. Field Crops Research, 95: 305–315.

Eppel, A., Keren, N., Salomon, E., Volis, S. and Rachmilevitch, S. (2013) The response of Hordeum spontaneum desert ecotype to drought and excessive light intensity is characterized by induction of O₂ dependent photochemical activity and anthocyanin accumulation. Plant Science, 201–202: 74–80.

Gill, S. S. and Tuteja, N. (2010) Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 909-930.

Guo, X. Y., Zhang, X.S. and Huang, Z.Y. (2010) Drought tolerance in three hybrid poplar clones submitted to different watering regimes. Journal of Plant Ecology, 3: 79–87.

Heath, R. L. and Packer, L. (1969) Photoperoxidation in isolated chloroplast, kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry, 125:189-198.

Kaplan, F. and Guy, C. L. (2004) Beta-Amylase induction and the protective role of maltose during temperature shock. Plant Physiology, 135: 1674–1684.

Khazaie, H. R. and Borzooei, A. (2006) Effects of water stress on antioxidant activity and physiological characteristics of wheat. The First International Conference on the Theory and Practices in Biological Water Saving (ICTPB), Beijing China.

Li, F., Bao, W. and Wu, N. (2011) Morphological, anatomical and physiologicalresponses of Campylotropis polyantha (Franch.) Schindl. seedlings to progressive water stress. Scientia Horticulturae, 127: 436 443.

Li, Y., Lee, K. K., Walsh, S., Smith, C., Hadingham, S., Sorefan, K.,Cawley, G. and Bevan, M.W. (2006) Establishing glucose- and ABA-regulated transcription networks in Arabidopsis by microarray analysis and promoter classification using a Relevance Vector Machine. Genome Research, 16: 414–427.

Lugan, R., Niogret, M. F., Leport, L., Guegan, J. P., Larher, F. R., Savoure, A., Kopka, J. and Bouchereau, A. (2010) Metabolome and water homeostasis analysis of Thellungiella salsuginea suggests that dehydration tolerance is a key response to osmotic stress in this halophyte. The Plant Journal, 64: 215–229.

Munne-Bosch, S., and Penuelas, J. (2003) Photo and antioxidative protection, and a role for salicylic acid during drought and recovery in field-grown Phillyrea angustifolia plants. Planta, 217: 758–766.

Munns, R., James, R. A. and Lauchli, A. (2006) Approaches to increasing the salt tolerance of wheat and other cereals. Journal of Experimental Botany, 57: 1025-1043.

Nevo, E. and Chen, G. (2010) Drought and salt tolerances in wild relatives for wheat and barley improvement. Plant, Cell and Environment, 33: 670–685.

Niknam S. R, Ma, Q. and Turner D. (2003) Osmotic adjustment and seed yield of Brassica napus and B. juncea genotypes in a water-limited environment in south-western Australia. Australian Journal of Experimental Agriculture, 43: 1127-1135

Pask, A. J. D., Pietragalla, J., Mullan, D. M. and Reynolds (eds.), M.P. (2012) Physiological Breeding II: A Field Guide to Wheat Phenotyping. International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT), pp. 133.

Reddy, A. R., Chaitanya, K. V. and Vivekanandan, M. (2004) Drought induced responses of photosynthesis and antioxidant metabolism in higher plants. Journal of Plant Physiology, 161: 1189- 1202.

Ranjan, R., Bohra, S. P. and Jeet, A. M. (2001) Book of plant senescence. Jodhpur, Agrobios New York pp 18- 42.

Reddy, T. Y., Reddy, V. R. and Anbumozhi. V. (2003) Physiological responses of groundnut (Arachis hypogea L.) to drought stress and its amelioration: a critical review. Plant Growth Regulation, 41: 75-88.

Reynolds, M. and Tuberosa, R. (2008) Translation research impacting on crop productivity in drought prone environments. Current Opinion in Plant Biology, 11: 171-179.

Sairam, R. K. and Srivastava,G. C. (2001) Water stress tolerance of wheat Triticum aestivum L.: Variation in hydrogen peroxide accumulation and antioxidant activity in tolerant and susceptible genotype. Journal of Agronomy and Crop Science, 186: 63-70.

Sánchez, D. H., Siahpoosh, M. R., Roessner, U., Udvardi, M. and Kopka, J. (2008) Plant metabolomics reveals conserved and divergent metabolic responses to salinity. Physiologia Plantarum, 132: 209–219.

Selote, D. S. and Chopra, R. K. (2010) Antioxidant response of wheat roots to drought acclimation. Protoplasma, 245: 153-163

Sio-Se Mardeh, A., Ahmadi, A., Poustini, K. and  Mohammadi, V. (2006) Evaluation of drought resistance indices under various environmental conditions. Field Crops Research, 98: 222–229.

Tahkokorpi, M. (2010) Anthocyanins under drought and drought-related stresses in blueberry (Vaccinium myrtillus L.). Faculty of Science, Department of Biology, University of Oulu, Finland. 46 p

Verslues, P. E., Agarwal, M., Katiyar-Agarwal, S., Zhu, J., and Zhu .J. K. (2006) Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status. Plant
Journal, 45:523–539.

Yan, J., Wang, F., Qin, H., Chen, G., Eviatar, N., Fahima, T. and Cheng, J. (2011) Natural Variation In Grain Selenium Concentration Of Wild Barley, Hordeum Spontaneum, Populations from Israel. Biological Trace Element Research, 142: 773–786.

Yang, F. and Miao, L. F.(2010) Adaptive responses to progressive drought stress in two poplar species originating from different altitudes. Silva Fennica, 44: 23–37.