بررسی خصوصیات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی ژنوتیپهای منتخب جو وحشی
(Hordeum vulgare ssp. spontaneum) در سطوح مختلف تنش خشکی
معصومه گنجی1، اسفندیار فرهمندفر2، مریم شهبازی3* و مهدی زهراوی4
1 گروه زراعت، اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، مازندران، ایران،
2 اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، مازندران، ایران
3 بخش تحقیقات فیزیولوژی مولکولی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی،
کرج، ایران، 4 بانک ژن ملی گیاهی ایران، مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر، کرج، ایران
(تاریخ دریافت: 04/05/93، تاریخ پذیرش نهایی: 20/03/1394)
چکیده:
خشکی یکی از مهمترین تنشهای غیرزنده است که رشد و نمو گیاهان را تحت تاثیر قرار میدهد. جو وحشی اسپانتانئوم (Hordeum vulgare ssp. spontaneum) والد جو زراعی است و دارای پتانسیل بالایی از لحاظ تحمل به تنش های محیطی می باشد. این بررسی بر روی 9 ژنوتیپ جو اسپانتانئوم برای تحمل به تنشخشکی در آزمایشی بصورت کرتهای خرد شده براساس طرح پایه بلوکهای کامل تصادفی با سه تکرار در مزرعه در سال 91-1390، تحت شلتر انجام شد. کرت اصلی شامل سه تیمار آبیاری عبارت از بدون تنش، قطع آبیاری از مرحله گلدهی و تنشخشکی بصورت عدم آبیاری و کرت فرعی بود نتایج نشان داد که اثر تنشخشکی بر عملکرد دانه، بیوماس، محتوای نسبی آب برگ، تنظیماسمزی، هدایت روزنهای، میزان کلروفیل کل،آنزیمهای آنتیاکسیدانی، پروتئین، مالون دیآلدهید، قند محلول کل و پرولین معنیدار (P<0.01) بود واکنش ژنوتیپها به خشکی از نظر صفات محتوای نسبی برگ، تنظیماسمزی، آنزیمهای آنتیاکسیدانی، پروتئین، مالون دیآلدهید، میزان کلروفیل کل و پرولین معنیدار (P<0.01) بود. نتایج بدست آمده از تجزیه به مولفههای اصلی براساس مجموع صفات مورد ارزیابی در شرایط تنشخشکی، ژنوتیپهای مورد بررسی را در چهار گروه قرار داد. گروه اول و دوم شامل ژنوتیپهای 6،4 و 5 بود.ژنوتیپهای اخیردر شرایط خشکی به صورت معنیداری از عملکرد دانه، محتوای نسبی آب برگ، هدایت روزنهای، میزان کلروفیل کل، فعالیت آنزیمهای پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز بالاتر و میزان مالوندیآلدهید و پتانسیل اسمزی پایینتر (منفیتر) برخوردار بودند، لذا به عنوان ژنوتیپهای متحمل شناخته شدند.
کلمات کلیدی: آنزیمهای آنتیاکسیدان، پروتئین، تنشخشکی، جو اسپانتانئوم، مالون دیآلدهید.
مقدمه:
تنشهای محیطی یکی از مهمترین عوامل کاهشدهنده عملکرد دانه و تولید گیاهان زراعی به شمار میروند از میان این تنش های غیرزنده، تنشخشکی تاحد زیادی پیچیدهترین تنش در مقیاس جهانی است که رشد و نمو گیاهان را تحت تاثیر قرار میدهد (Ceccarelli et al., 2008; Pennisi et al., 2010). عوامل ایجاد شرایط تنش، تعادل طبیعی را تغییر داده و منجر به یک سری تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی در گیاهان میشوند که تأثیر منفی بر رشد و تولید آنها دارد (Guo et al., 2010) که در نهایت منجربه کاهش میزان رشد و عملکرد نهایی محصول میشود
.(Guo et al., 2010; Ashraf, 2010) خشکی نه تنها روابط آبی گیاه را از طریق کاهش محتوای آب، کاهش فشار آماس و کاهش پتانسیل آبی کل تحت تاثیر قرار میدهد، بلکه موجب بسته شدن روزنهها، کاهش محتوی نسبی آب برگ، محدودیت تبادل گازی، کاهش تعرق و کاهش جذب کربن (فتوسنتز) نیز میشود.(Guo et al, 2010) در طی بروز تنشخشکی گیاهان با ذخیره ترکیبات آلی کوچک مولکولی به عنوان تنظیمکنندههای اسمزی همانند اسیدهای آمینه، قندها و تجمع برخی از یونهای معدنی در واکوئل سعی در حفظ تعادل اسمزی و مقابله با تنش دارند (Ashraf, 2009; Chimenti et al., 2006). به عنوان پیامد تجمع این مواد، پتانسیلاسمزی سلول کاهش مییابد و موجب جذب آب و نگهداری فشار تورژسانس سلول میشود (ابوالحسنی زراعتکار و همکاران، 1389). کربوهیدراتهای محلول و سایر مواد محلول سازگار (مانند پرولین) به عنوان اسمولیت برای حفظ فشار ترگر سلول، حفظ یکپارچگی غشا و جلوگیری از دناتوره شدن پروتئینها استفاده میشود (Bartels and Sunkar, 2005; Kaplan and Guy, 2004; et al.,2006).
از سوی دیگر خشکی مانند سایر تنشهای غیرزیستی، موجب تولید بیش از حد گونههای فعال اکسیژن
Reactive Oxygen Species (ROS) در گیاهان میشود. ROS میتواند به غشای سلولی، اسیدهای نوکلئیک، پروتئینها و کربوهیدراتها آسیب وارد نماید (Ashraf, 2009; Gill and Tuteja, 2010) و باعث عدم تعادل متابولیک در گیاهان شود. ROS از رادیکالهای آزاد و مولکولهای غیر رادیکال (پراکسید هیدروژن، H2O2 و اکسیژن یگانه، O2) تشکیل شده است (Munne-Bosch and Penuelas, 2003; Gill and Tuteja, 2010). گیاهان جهت مقابله با تنش اکسایشی ناشی از رادیکالهای فعال اکسیژن دارای مکانیزمهای ضد اکسایش آنزیمی (سوپر اکسید دیسموتاز، SOD؛ کاتالاز، CAT؛ آسکوربات پراکسیداز، APX؛ گلوتاتیون ردوکتاز، GR؛ مونو دهیدروآسکوربات ردوکتاز، MDHAR؛ دهیدروآسکوربات ردوکتاز، DHAR؛ گلوتاتیون پراکسیداز، GPX؛ گایاکول پراکسیداز، GOPX؛ گلوتانیون اس ترانسفراز، GST) و غیرآنزیمی (آسکوربیک اسید، ASH؛ گلوتاتیون، GSH؛ ترکیبات فنولی، آلکالوئید، آمینو اسیدهای غیر پروتئینی، و آلفا توکوفرولها) میباشند .(Gill and Tuteja, 2010)پژوهشگران نشان دادند که تحت تنشخشکی فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان در گندم (Khazaie and Borzooei, 2006) و جو (Ahmed, 2013) به طور معنیداری افزایش یافت.
تنوع ژنتیکی در جو زراعی به علت اصلاح آن به طور فزایندهای محدود شده است واین امر باعث ایجاد مشکل در سازش این گیاه با شرایط نامساعد محیطی از قبیل تنشهای زنده مانند بیماریها و تنشهای غیرزیستی میشود (زهراوی و همکاران، 1390). از آنجایی که خویشاوندان وحشی گیاهان زراعی پتانسیل بالایی از لحاظ تحمل به تنشهای زیستی وغیر زیستی را دارا هستند (Nevo and Chen, 2010) و جو اسپانتانئوم (Hordeum vulgare ssp spontaneum L.) به عنوان جد جوزراعی است که دارای خزانه ژنی غنی از نظر مقاومت در برابر تنش های محیطی زنده و غیرزنده بوده و از نظر تعداد کروموزوم مشابه جو زراعی میباشد و هیچ مانع بیولوژیکی برای تلاقی بین این دو گونه وجود ندارد (Yan et al., 2011).
هدف از این تحقیق بررسی تنوع بین ژنوتیپهای منتخب جو وحشی در صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی دخیل در تحمل به خشکی و همچنین ارتباط بین این صفات و بیوماس و عملکرد دانه در شرایط تنشخشکی به منظور دستیابی به منابع ژنتیکی جدید برای اصلاح ارقام زراعی جو میباشد. ژنوتیپهای مورد بررسی در این پژوهش که واکنش متفاوتی به خشکی دارند براساس گزینش مقدماتی به منظور ارزیابی تحمل به خشکی در بین 100 نمونه جمعآوری شده در کشور (زهراوی و همکاران، 1387؛ زهراوی، 1388) انتخاب شدند.
مواد و روشها:
این پژوهش به صورت کرتهای خرد شده براساس طرح پایه بلوکهای کامل تصادفی در سه تکرار در مزرعه تحقیقاتی بانک ژن گیاهی ملی ایران واقع در کرج (51 درجه و 10 دقیقه طول شرقی و 35 درجه و 48 دقیقه عرض شمالی و ارتفاع
جدول 1- شماره ژنوتیپهای جو وحشی اسپانتانئوم مورد مطالعه برای ارزیابی تحمل به تنشخشکی
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
شماره ژنوتیپ |
1089 |
1007 |
971 |
555 |
434 |
374 |
312 |
310 |
220 |
شماره بانک ژن |
لرستان |
کرمانشاه |
ایلام |
فارس |
آذربایجان غربی |
تهران |
لرستان |
منشا ژنوتیپ |
1321 متر از سطح دریا) در سال زراعی 91-1390 تحت شلتر اجرا شد. کرت اصلی شامل سه عامل عبارت از 1) بدون اعمال تنشخشکی (شاهد) 2) قطع آبیاری از مرحله گلدهی تا پایان فصلرشد (تنش متوسط) 3) تنشخشکی بصورت عدم آبیاری (فقط یکبار انجام آبیاری در حد استقرار گیاه) (تنش شدید) و تعداد 9 (ژنوتیپ) جو وحشی اسپانتانئوم (جدول 1) به عنوان عامل فرعی منظور شد. هر نمونه ژنوتیپی بر روی سه ردیف کشت شد. هر ردیف به طول دو متر و فاصله 60 سانتیمتر بین ردیفها در نظر گرفته شد.
نمونه برداریها و اندازهگیریها: نمونه برداریها جهت بررسی صفات فیزیولوژی و بیوشیمیایی در آزمایشهای شاهد، قطع آبیاری از گلدهی در20روز پس از گلدهی زمانی که در صد رطوبت خاک در شرایط شاهد 19/17 درصد، در تنش متوسط 08/8 در تنش شدید به 82/6 رسید صورت گرفت.
عملکرد دانه و بیوماس: در زمان برداشت از سطح کل کرت بصورت کف بر از سطح خاک، از هر یک از واحدهای آزمایشی شد و پس از خشک شدن کامل و توزین گیاهان برداشت شده، بیوماس و عملکرد دانه هر کرت (2/1 متر مربع) بدست آمد.
محتوای نسبی آب برگ (RWC): محتوای نسبی آب برگ پرچم، با استفاده از معادله (1) محاسبه شد .(Pask et al., 2012)
معادله (1) %RWC= (FW-DW/TW-DW)* 100
وزن نمونههای خشک (DW)،وزن آماسی (TW)، وزن تر برگ (FW)
هدایت روزنهای: به منظور ارزیابی میزان هدایت روزنهای، از هر کرت 10 بوته به صورت تصادفی انتخاب و میزان هدایت روزنهای برگ پرچم در ساعت 10-9 صبح توسط دستگاه POROMETERمدل AP4- DELTA- T DEVICES اندازهگیری و میانگین اعداد بر اساس میلیمول بر مترمربع در ثانیه (mmol m-2 s-1) برای هر کرت ثبت گردید.
تنظیماسمزی: برای محاسبه مقدار تنظیماسمزی کل در گیاه از اختلاف پتانسیلاسمزی برگهای گیاهان شاهد و تحت تنش در شرایط آماس کامل استفاده گردید. بدین ترتیب که برگ پرچم هر بوته شامل گیاهان تحت تنش و گیاهان شاهد در مرحله 20 روز پس از گلدهی، به مدت 24 ساعت در آب مقطر با دمای چهار درجه سانتیگراد در شرایط تاریکی غوطهور گردید تا همه برگها به آماس برسند. سپس با استفاده از دستگاه اسمومتر مقدار پتانسیلاسمزی برگها محاسبه شد. از اختلاف مقدار پتانسیلاسمزی برگ تحت تنش با برگ شاهد، مقدار تنظیماسمزی کل طبق رابطه ذیل بدست آمد (Blum, 1989).
معادله (2 ) OAtot = ψSc100 – ψSs100
در این معادله OAtot مقدار تنظیماسمزی کل، ψSc100 مقدار پتانسیلاسمزی گیاه شاهد در آماس کامل، ψSs100 مقدار پتانسیلاسمزی گیاه تحت تنش در صد در صد آماس می باشد.
میزان پرولین و قند محلول کل: اندازهگیری میزان پرولین با استفاده از روش Bates و همکاران (1973) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 اندازهگیری شد. برای اندازهگیری میزان قند از روش تغییر یافته فنل و اسید سولفوریک (AOAC، 1995) استفاده شد. ابتدا بر روی مقدار 02/0 گرم ماده خشک برگ،5/1 میلیلیتری از اتانول 80% با دمای 70 درجه سانتیگراد اضافه شد و پس از تکان دادن شدید نمونهها با 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و پس از آن محلول شناور رویی را، به فالکون 15 میلیلیتری منتقل شد. این مرحله و شستشوی رسوب سه بار تکرار شده و سپس محلول داخل فالکون در آون 45 درجه سانتیگراد به طور کامل تبخیر شد و رسوب باقیمانده برای اندازهگیری قند محلول کل و جزء مورد استفاده قرار گرفت. برای اندازهگیری قند کل به رسوب داخل فالکون آب مقطر اضافه شد و پس از حل شدن کامل آن، اسید سولفوریک 98% و فنل 10% به آن اضافه گردید و پس از 45 دقیقه میزان قند کل توسط Spectrophotometer Infinite M200 PRO- TECAN در طول موج 485 نانومتر بررسی گردید.
اندازه گیری میزان کلروفیل و غلظت مالون دیآلدهید: کلروفیل برگ با استفاده از استون 80% استخراج گردید و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر میزان جذب را در چهار طول موجnm 510 ، nm480، nm646 و nm663 قرائت گردید و میزان رنگیزههای موجود به روش Arnon(1949) محاسبه شد.
به منظور اندازهگیری غلظت مالون دیآلدهید توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد. غلظت مالون دیآلدهید با استفاده از معادله (3) محاسبه گردید Heath and Packer, 1969)):
معادله (3) MDA(nmol/ml) =[(A532 – A600)/ 157000] 106
در این معادله MDA مالون دیآلدهید بر حسب mL-1nmol.، جذب در طول موجهای 532A و 600Aمیباشد
اندازهگیری پروتئین و آنزیمهای آنتیاکسیدانی: میزان پروتئین محلولکل طبق روش Bradford(1979) با استفاده از عصاره استخراج شده توسط بافر اندازهگیری شد و در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Cary 300) UV-Visible spectrophotometer قرائت گردید.
اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Aebi (1984) در طول موج 240 نانومتر، میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز طبق روش Nakanoو Asada (1978) در طول موج 290 نانومتر، فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس روش Chance و Maehly (1955) در طول موج 470 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه بر حسب جذب در دقیقه(Abs/min) به وسیله دستگاه (Cary 300) UV-Visible Spectrophotometer ترسیم شد.
تجزیه و تحلیل دادهها: دادههای حاصل از آزمایش با نرمافزار (Ver 9.1) SAS مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت، میانگین دادهها با آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد مقایسه شد و نمودارهای لازم با نرمافزار Excel رسم گردید. همچنین پس از استاندارد کردن دادههای مربوط به صفات مورد نظر و عملکرد دانه در شرایط تنش و بدون تنش، تجزیه به مؤلفههای اصلی (Principal Component Analysis) انجام شد و نمودار بایپلات آنها بااستفاده از نرمافزار
(ver 9.1) SAS ترسیم گردید.
نتایج و بحث:
عملکرد دانه و بیوماس: با توجه به نتایج به دست آمده اثر ژنوتیپ و تنش برای صفت و بیوماس و همچنین واکنش ژنوتیپها در سطوح مختلف خشکی اعمال شده معنیدار (P<0.01) بود و همچنین اثر تنش و ژنوتیپ نیز بر عملکرد دانه معنیدار (P<0.01) بود (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). با افزایش سطح تنشخشکی بیوماس در ژنوتیپها کاهش پیدا کرد (جدول 2) که بیشترین بیوماس در شرایط تنش شدید مربوط به ژنوتیپ 4 به میزان 481 گرم و کمترین بیوماس در شرایط تنش شدید مربوط به ژنوتیپ 9 به میزان 282 گرم بود (جدول 3). در بررسی صفت عملکرد دانه ژنوتیپ 6 ،5 و 4 دارای بیشترین عملکرد بودند (جدول 3). محققین بسیاری کاهش عملکرد دانه گندم و جو را در شرایط تنشخشکی گزارش کرده اند (Sio-Se Mardeh, 2006). تولید ماده خشک در گیاهان یکی از مهمترین عوامل تاثیر گذار روی عملکرد می باشد. محققان زیادی پیشرفت عملکرد را در طی سالهای اخیر به دلیل افزایش ماده خشک گیاه دانسته اند. به عبارتی دیگر ارقامی از جوکه هم دارای عملکرد بیولوژیک بالا و هم دارای شاخص برداشت بالا بودند به احتمال زیاد دارای عملکرد بالا خواهند بود (Reynolds and Tuberosa, 2008). با توجه به تاثیر خشکی بر بیوماس، احتمالا اجزای عملکرد مورد تاثیر قرار گرفته و در نتیجه منجر به کاهش معنیدار عملکرد دانه شده است. نتایج بدست آمده در این آزمایش با نتایج ارزیابیهای مقدماتی انجام شده توسط زهراوی و همکاران (1387) برروی 100 اکوتیپ جو وحشی اسپانتانئوم جمعآوری شده از مناطق مختلف کشور مطابقت داشت.
محتوای نسبی آب برگ و هدایت روزنهای: اولین پاسخ
جدول 2- مقایسه تنظیم اسمزی نه ژنوتیپ منتخب جو وحشی اسپانتانئوم در دو سطح تنشخشکی ملایم وتنشخشکی شدید
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
ژنوتیپ ها سطوح تنش |
11/0 |
02/0 |
07/0 |
14/0 |
03/0 |
16/0 |
19/0 |
05/0 |
02/0 |
تنش متوسط |
15/0 |
02/0 |
12/0 |
20/0 |
24/0 |
24/0 |
06/0 |
09/0 |
18/0 |
تنش شدید |
جدول 3- مقایسه صفات مورد بررسی در سطوح تنش آبی و شاهد در نه ژنوتیپ منتخب جو اسپانتانئوم در مزرعه
سطوح تنش |
(%)RWC |
هدایت روزنهای (mmol.m-2.s-1) |
کلروفیل کل (mg.ml-1) |
بیوماس (g.m-2) |
عملکرد دانه (g.m-2) |
شاهد |
76/2 a |
361/7a |
9/0 a |
6/398 a |
4/100a |
تنش متوسط |
3/53 b |
97b |
0/8 b |
3/313 b |
6/67b |
تنش شدید |
8/31c |
66/2c |
0/7c |
3/259c |
3/51c |
همه گیاهان به کمبود آب، بستن روزنهها جهت کاهش اتلاف آب از طریق تعرق میباشد محتوای نسبی آب برگ میزان کمبود آب را نشان میدهد و ممکن است شاخصی برای نشان دادن شدت تنشخشکی باشد (Pask et al., 2012). در این بررسی اعمال تیمارهای قطع آبیاری سبب کاهش معنیدار (P<0.01) محتوای نسبی آب برگ و هدایت روزنهای در مقایسه با تیمار شاهد شد (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). همچنین واکنش ژنوتیپها در سطوح مختلف خشکی اعمال شده از نظرRWC معنیدار (P<0.01) بود (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده) با توجه به اختلاف زیاد بین سطوح تنش تجزیه واریانس صفت هدایت روزنهای به صورت جداگانه از روش برشدهی فیزیکی (Physical Slicing)صورت پذیرفت و نتایج نشان داد اختلاف ژنوتیپها در تنش متوسط (قطع آبیاری بعد از گلدهی) معنیدار (P<0.01) است (جدول تجزیه واریانس ارائه نشده). با توجه به نتایج حاصل از مقایسه میانگین ژنوتیپها این صفت ژنوتیپ 4، 5 و 6با میزان 192، 2/182 و 6/179 میلیمول بر مترمربع در ثانیه به صورت معنیداری دارای بیشترین هدایت روزنهای بودند همچنین در بررسی میزان RWCنتایج بیانگر این موضوع است که ژنوتیپ 6 در مقایسه با سایر ژنوتیپها در شرایط تنش دارای محتوای رطوبت نسبی بیشتر است (جدول 3، شکل 1-a). هر چند که کاهش میزان RWC در شرایط تنش در اکثر مطالعات اشاره شده است اما به طور معمول، ژنوتیپهایی که RWC بالاتری در شرایط تنشخشکی دارند، ژنوتیپهای متحملتری خواهند بود (Pask et al., 2012; Eppel et al., 2013). همچنین Eppel و همکاران (2013) در ارقام جو گزارش کردند تنشخشکی آخر فصل، محتوای نسبی آب برگ و هدایت روزنهای ارقام جو را به طور معنیدار کاهش داده است.
تنظیماسمزی و متابولیتهای سازگار: تنظیماسمزی یکی از مولفههای اصلی فیزیولوژیکی در گیاهان در پاسخ به تنشخشکی است (Niknam and Turner, 2003). تنظیماسمزی در تیمار تنش شدید در تمامی ژنوتیپهای مورد بررسی به جزء ژنوتیپهای 3 و 8 پس از اعمال تنش روند افزایشی داشته و بین ژنوتیپهای 5، 4 و 6 به ترتیب بالاترین تنظیم را نسبت به ژنوتیپهای دیگر از خود نشان داد که میتواند نشاندهنده برتری این ژنوتیپهای در تحمل به تنشخشکی باشد (جدول4) (لازم به ذکر است که صفت تنظیماسمزی از تفاضل تنظیماسمزی در شرایط تنش وشاهد است در نتیجه تنها یک سری داده که مربوط به تنظیماسمزی در شرایط تنش است مورد ارزیابی قرار گرفته میشود). افزایش مواد اسمزی به دو صورت، افزایش جذب مواد معدنی به ویژه پتاسیم و تجزیه ترکیبهای بزرگ مانند نشاسته و یا سنتز ترکیبات آلی مانند
1 2 3 4 5 6 7 8 9 |