فرآیند و کارکرد گیاهی

تأثیر باران اسیدی بر ویژگی­های ریخت­شناسی و
فیزیولوژیکی افرای پلت (Acer velutinum Boiss)

وهب جعفریان^*1، مهدی صالحی² و رضا فتوحی قزوینی²

¹گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زنجان، ²گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان

 (تاریخ دریافت: 18/09/93، تاریخ پذیرش نهایی: 05/02/1394)

چکیده:

باران اسیدی ناشی از فعالیت­های صنعتی یکی از تنش­های جدی است که وقوع آن در اغلب مناطق ایران در سال­های آینده محتمل است. به­منظور درک بهتر اثر این تنش بر غشاء سلول، کلروفیل، تولید رادیکال­های اکسیژن و تاثیری که بر گیاهان دارد بطور موردی، رفتار درخت زینتی-صنعتی افرای پلت در برابر این آلاینده هوا مورد مطالعه قرار گرفت. از این­رو، نهال­های این درخت در معرض باران اسیدی شبیه­سازی­شده در قالب طرح کاملاً تصادفی در چهار سطح pH: 3، 4، 5، و 6 به­عنوان شاهد، و در سه تکرار به­مدت ده روز، قرار گرفتند. در پایان آزمایش، برخی تغییرهای ظاهری از قبیل لکه­های بافت­مرده و خمیدگی حاشیه برگ تنها در گیاهان مواجه­شده با باران اسیدی دارای 3 = pH مشاهده شد. نتایج نشان داد که با افزایش اسیدیته باران اسیدی میزان نشت یونی (EL) و پراکسیداسیون لیپید (LPO) به­طور معنی­داری افزایش یافت. میزان کلروفیل کل در برگ­ها در مواجهه با باران اسیدی دارای 3 = pH به­طور چشمگیری کاهش یافت. این تغییرات حاکی از آسیب غشاء سلول و کاهش سطح فتوسنتز بود. بنابر نتایج به­دست­آمده، فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD) تحت تأثیر باران اسیدی قرار نگرفت، در حالی­که میزان فعالیت آنزیم­های پراکسیداز (POD) و آسکوربات­پراکسیداز (APX) در گیاهان مواجه­شده با باران اسیدی دارای 3 = pH به­طور چشمگیری کاهش یافت. کاهش ظرفیت آنتی­اکسیدانی مصادف با بروز آسیب بود. به عبارت دیگر افرای پلت در برابر باران اسیدی تا 4 = pH بدلیل افزایش آنتی­اکسیدان­ها مقاوم بوده ولی در برابر باران اسیدی دارای 3 = pH و بی­تردید pH­های پایین­تر، به دلیل افزایش رادیکال­ها، کاهش فتوسنتز و پراکسیده شدن غشاء آسیب مشهود شد.

واژه­های کلیدی: آلودگی هوا، آنزیم­های آنتی­اکسیدان، افرا، تنش باران اسیدی، لیپید پراکسیداسیون.

مقدمه:

باران­های اسیدی به­وجودآمده به­واسطه فعالیت­های دست­ساخت بشری (anthropogenic activities) یکی از مهمترین انواع آلاینده­های ثانویه هوا به­شمار می­آیند. وجود جریانات جوی و بادها می­توانند آلاینده­های هوا را تا مناطقی دورتر از خواستگاهشان انتقال دهد و باعث ایجاد بحران در آن مناطق گردد (Bouwman et al., 2002; Prihatin et al., 2015). امروزه به بارشی با pH کمتر از 6/5 باران اسیدی می­گویند. بارش اسیدی بیشتر در نتیجه­ی حل­شدن دی­اکسیدگوگرد (SO₂) و اکسیدهای نیتروژن (NOX) با بخار آب موجود در اتمسفر است (Kita et al., 2004; Kumar et al., 2001). این گازهای سمی بیشتر در مناطق صنعتی تولید می­شوند و بسته به غلظت با نسبت­های مختلفی همراه با دیگر ترکیبات در باران اسیدی وجود دارند (Wu and Han, 2015).

باران اسیدی با اسیدی کردن آب رودخانه­ها و دریاچه­ها شرایط زندگی آبزیان را به خطر می­اندازد (Botkin and Keller, 2003)، همچنین باعث آسیب به بناهای تاریخی می­گردد
(Bear, 1964). باران اسیدی با کم کردن pH خاک باعث آزادسازی عناصر سمی مانند آلومینیوم گردیده و نیز فعالیت آن دسته از ریزاندام­واره­های مفید خاک که در دامنه­های بالای pH فعالند را کاهش می­دهد و در نتیجه از حاصلخیزی خاک می کاهد (et al., 2007 King et al., 2006; Zhang). باران­های اسیدی به­طور مستقیم در مواجه با برگ­های گیاهان بر آنان اثر گذاشته و سبب کاهش سرعت رشد (Silva et al., 2005) و در pH های پایین­تر حتی منجر به ریزش نابهنگام، پیری و مرگ گیاه می­شود. مقدار زی­توده بخش بالای سطح زمین و بخش زیرزمینی گندم تحت باران اسیدی کاهش یافتند (Singh et al., 2007). باران اسیدی همچنین بر روی اندام­های تولید مثل گیاهی اثر دارد. در بررسی­های Bellani و همکاران (1997) بر روی اثرات باران اسیدی بر دانه­ گرده سیب مشاهده شد که باران اسیدی به­طور چشمگیری باعث کاهش زیوایی و جوانه­زنی دانه گرده می­گردد. همچنین مشخص شده است که باران اسیدی بر فراساختارهای کلروپلاست اثر می­گذارد و میزان فتوسنتز خالص را بسیار تحت تأثیر قرار می­دهد (Wen et al., 2011). کاهش میزان pH باران اسیدی بر میزان کلروفیل برگ گیاهان نیز تأثیر بسزایی دارد (Wyrwicka and Skłodowska, 2006). بنابر پژوهش­های Velikova و همکاران (2000) باران اسیدی بر تخریب غشای یاخته­ها اثرات قابل توجه­ای می گذارد. تولید انواع گونه­های واکنش­پذیر اکسیژن یا ROS (Reactive Oxygen Species) یک رخداد اولیه تحت شرایط مختلف تنش است (Noctor and Foyer, 1998). ROS ها در گیاه تحت تنش باران اسیدی در برگ­ها به وجود می­آیند
(Wang et al., 2014). تنش اکسیداتیو در پاسخ به تنش باران اسیدی در گیاهان در نتیجه تولید انواع ROS نیز ایجاد می­شود (Gabara et al., 2003). اکسیژن فعال تولیدشده تحت تنش، عامل اصلی پر­اکسیداسیون لیپید­ها، غیرفعال کردن آنزیم­ها و آسیب­های اکسیداتیو به DNA است (Athar et al., 2008). با این حال، در برخی گیاهان بیان ژن­ آنزیم­های آنتی­اکسیدانی به­خاطر آلودگی هوا توسط Kubo و همکاران (1995) گزارش گردیده است.

افرای پلت (Acer velutinum Boiss.) درختی با شاخساره های بزرگ و بومی جنگل­های شمال ایران است، نورپسند بوده و در بوستان­ها و فضاهای سبز شهری و در صنعت چوب مورد استفاده قرار می­گیرد (Wiersema and Blanca, 1999). از آنجا که پژوهش­های ناچیزی درباره­ی اثر آلاینده­های هوا بر درختان بومی ایران صورت پذیرفته و اطلاعات کمی در زمینه اثرهای فیزیولوژی و بیوشیمیایی باران اسیدی بر گیاهان در دسترس است، و همچنین از آنجا که گونه­های پهن­برگ نسبت به ­گونه های باریک­برگ در برابر باران اسیدی حساس­تر هستند (Wyrwicka and Skłodowska, 2006)، گیاه افرای پلت که در ایجاد فضای سبز با نقش سایه انداز کاربرد دارد و از طرفی دارای ویژگی­های زیباشناختی شکل برگ و میوه و نیز دارای رشد سریع است، انتخاب گردید تا تاثیر تیمارهای مختلف باران اسیدی روی گیاه مورد مطالعه قرار گیرد. بنابراین، تعدادی از شاخص­های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی پس از اعمال تیمارها اندازه گیری شد تا شدت آسیب باران اسیدی و مقاومت گیاه مشخص گردد.

مواد و روش­ها:

مواد گیاهی: برای انجام این آزمایش از نهال­های سه ­­ساله­ی افرا استفاده شد. نهال­ها به­صورت هم اندازه به گلدان­های پلاستیکی بزرگ (70 سانتی­متر درازا، 40 سانتی­متر پهنای دهانه­) حاوی ماسه و کود دامی کاملا پوسیده به نسبت حجمی 2:1 که در ته آن­ها چهار عدد سوراخ برای زه­آب ایجاد شده  بود، انتقال داده ­شدند. جهت سازگاری، استقرار نهال­ها و رشد بعدی، به مدت یک ماه با محلول هوگلند هر سه روز یکبار و سپس به­طور میانگین هر پنج روز آبیاری شدند. این آزمایش در گلخانه دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان (رطوبت 75 درصد، بیشینه و کمینه دما به ترتیب 26 و 16 درجه سانتی­گراد) انجام پذیرفت.

جدول 1- ترکیب باران اسیدی (Seufert et al., 1990)

شیوه اعمال تیمارها: یک ماه پس از استقرار در گلدان، نهال­ها در قالب طرح کاملا تصادفی در معرض چهار سطح باران اسیدی (pH­ های 3، 4، 5، و 6 به­عنوان شاهد) که طبق روش Seufert و همکاران (1990) فراهم شده بود (جدول 1)، قرار گرفتند. باران اسیدی به­صورت محلول­پاشی روزانه و به مدت 10 روز انجام گرفت. در این تیمار از تویین 80 به­ عنوان سورفکتانت استفاده گردید. نمونه­های برگی 24 ساعت پس از آخرین محلول­پاشی_، از بخش­های گوناگون گیاه، معمولاً از برگ­های گره­های دوم، سوم و چهارم مانده به جوانه انتهایی که فعالیت فیزیولوژیکی بالایی دارند، گرفته و بی­درنگ به آزمایشگاه برده شدند تا میزان فعالیت آنزیم­های سوپراکسیددیسموتاز، آسکوربات­پراکسیداز و پراکسیداز، میزان پراکسیداسیون لیپید، کلروفیل کل و نشت یونی در آن­ها اندازه گیری شوند.

اندازه­گیری فعالیت آنزیمی: به منظور استخراج و اندازه گیری آنزیم، برگ­های تازه از گیاه جدا و در هاون چینی با نیتروژن مایع کاملاً هموژنیزه شدند. میزان 1/0 گرم از برگ منجمد شده با نیتروژن مایع با یک میلی­لیتر از بافر استخراج (بافر فسفات ۱۰۰ میلی­مولار با 7 = pH که حاویmM EDTA  1/0 و w/v PVPP %2) به مدت ۱۵ دقیقه با ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سلسیوس، سانتریفوژ شدند. از بخش رویی (سوپرناتانت) برای سنجش آنزیم­های آنتی­اکسیدانت، پراکسیداسیون لیپیدها و تعیین غلظت پروتئین کل (نتایج نشان داده نشده)  استفاده شد (De Azevedo et al., 2006).

تعیین فعالیت آنزیم سوپراکسید­دیسموتاز: فعالیت کل آنزیم سوپراکسید­دیسموتاز با اندازه‌گیری توانایی‌اش در جلوگیری از کاهش فتوشیمیایی نیتروبلوتترازولیوم (NBT) تعیین شد. سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(SOD) در مخلوط واکنش به حجم 5/1 میلی­لیتر و دارای بافرفسفات (5۰ میلی مولار 8/7 = pH)، mM EDTA 1/0، متیونین mM 13، نیتروبلوتترازولیوم (NBT) μM 75، ریبوفلاوینμM 2 و 50 میکرولیتر عصاره خام آنزیمی انجام گردید. اندازه­گیری فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD) به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۶۰ نانومتر انجام گردید. یک واحد (1U) از SOD به مقداری از آنزیم گفته می­شود که سبب 50% مهار احیای NBT به فرمازان تحت شرایط یاد شده شود. تفاوت بین جذب هر عصاره در مدت زمان روشنایی ۱۶ دقیقه و جذب عصاره بدون آنزیم (کنترل) در همان زمان روشنایی در واقع نشان دهنده بازداشت واکنش خودبخودی و تشکیل فرمازان توسط  SODاست (Giannopolitis and Ries, 1977).

برای تعیین فعالیت مخصوص آنزیم SOD گیاهی بر حسبUnit/mg protein  از فرمول زیر استفاده می­شود:

روش سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز: برای سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز ابتدا بافر فسفات 50 میلی مولار، EDTA  یک میلی مولار، آسکوربات 5/0 میلی مولار و پراکسید هیدروژن یک میلی مولار تهیه شد. سپس سنجش توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در کووت­های کوارتز در طول موج 290 نانومتر انجام شد (Nakano and Asada, 1981). اگر تغییرهای جذب علیه زمان (OD/min) به ثابت mM^-1cm^-18/2 تقسیم شود فعالیت آنزیمی به­دست می‌آید. برای تعیین فعالیت مخصوص آنزیم آسکوربات پراکسیداز گیاهی از فرمول زیر استفاده می­شود که فعالیت مخصوص برحسب Unit/mg protein به دست می­آید،، که یک واحد آنزیمی معادل تجزیه یک میکرومول آسکوربات در مدت زمان یک دقیقه و در دمای ۲۵ درجه سلسیوس است.

روش سنجش فعالیت آنزیم ­پراکسیداز: فعالیت پراکسیداز به روش Nakano و Asada (1981) اندازه­گیری شد. محلول بافری واکنش شامل 50 میلی­مولار بافر KH₂PO₄ (7 = pH)، 1/0 میلی­مولار EDTA، 1/0 میلی­مولار H₂O₂، و 10 میلی­مولار گایاکول بود. واکنش با افزودن محلول نمونه­ها به محلول بافری واکنش، آغاز شد. فعالیت آنزیم با تغییر جذب دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر به­مدت 30 ثانیه و ضریب خاموشی 6/26 میلی­مولار بر سانتی­متر محاسبه گردید، و بر حسب U/mg protein بیان شد. یک واحد فعالیت این آنزیم معادل تشکیل یک میکرومول تتراگایاکول در دقیقه است.

پراکسیداسیون لیپیدها: برای سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا، مقدار 5/0 گرم از نمونه درون لوله آزمایش قرار داده شد و 5 میلی­لیتر بافر پتاسیم­فسفات ۵۰ میلی­مولار به آن اضافه گردید. نمونه حاصله در دمای 4 درجه سلسیوس به مدت 30 دقیقه با دور 14000در دقیقه سانتریفوژ شد. به 1 میلی­لیتر از محلول سانتریفوژ شده 1 میلی­لیتر محلول 5/0 درصد (W/V) اسید تیوباربیتیوریک که حاوی اسید تری کلرواستیک 20 درصد (W/V) است، اضافه گردید و مخلوط در حمام آب داغ تحت دمای 95 درجه سلسیوس به مدت 30 دقیقه حرارت داده شد. به منظور توقف واکنش، ظرف محتوی مخلوط حرارت داده شده به سرعت درون حمام یخ به مدت30 دقیقه قرار داده شد. سپس مخلوط سرد شده با دور 10000 در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ گردید. غلظت مالون­دی­آلدهید (MDA) و سایرآلدئید­های تولیدشده توسط واکنش با تیوباربیتوریک­اسید (TBA) که سبب تشکیل کمپلکس قرمز (MDA-TBA) در طول موج 532 نانومتر می شود توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد، سپس جذب بقیه رنگیزه­های غیر اختصاصی در 600 نانومتر تعیین شد و از میزان جذب در 532 نانومتر کسر گردید. برای محاسبه غلظت MDA از ضریب خاموشی معادل mM-¹cm-¹ 155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون­دی­آلدهید که محصول پراکسیداسیون لیپیدها است بر اساس میکرومول در گرم وزن خشک محاسبه گردید (Heath and Packer, 1968).

اندازه­گیری نشت یونی و تعیین کلروفیل کل: برای اندازه گیری نشت یونی (EL)، برگ­های هر نمونه را به طول 2 میلی متر قطعه قطعه و در لوله­های آزمایشگاهی قرار داده شدند و سپس 10 میلی­لیتر آب مقطر به آن­ها اضافه شد و در دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. پس از 12 ساعت، هدایت الکتریکی اولیه محیط (EC₁) با استفاده از دستگاه EC سنج مدل Milwaukee Mi 306 اندازه­گیری شد. سپس نمونه­ها در دمای 100 درجه سانتی­گراد به مدت 20 دقیقه جوشانده شدند تا به­طور کامل همه­ی الکترولیت­های موجود در بافت­ها آزاد شوند. بعد از آن نمونه­ها تا دمای 25 درجه سانتی­گراد خنک شدند و هدایت الکتریکی ثانویه (EC₂) اندازه­گیری شد و میزان EL با استفاده فرمول EL = (EC1 / EC2) 100 محاسبه شد. برای اندازه­گیری کلروفیل مقدار 05/0 گرم از بافت تازه برگ گیاه با 1 میلی­لیتر استون 80 درصد مخلوط و به مدت 10 دقیقه با سرعت rpm 6000 سانتریفیوژ شد و در نهایت عصاره استونی شفاف را جدا کرده و پس از قرار دادن در نیم ساعت تاریکی، اندازه­گیری کلروفیل با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر  و در دو طول موج 663 و 645 نانومتر انجام گرفت و در نهایت میزان کلروفیل کل  طبق فرمول زیر به دست آمد (and Dionisio-Sese, 1998 Tobita).

Total Ch = [۲/۲۰ (A ۶۴۵) + ۲/۸0 (A ۶۶۳)] V/100W

تجزیه آماری: این پژوهش در قالب طرح کاملا تصادفی با تیمار باران اسیدی در چهار سطح و سه تکرار انجام گرفت. تجزیه آماری داده­ها با نرم­افزار (9.1) SAS و مقایسه میانگین­ داده­ها با آزمون توکی و رسم نمودارها با نرم­افزار Excel  انجام شد.

نتایج:

میزان نشت یونی و پراکسیداسیون لیپید: میزان نشت یونی با کاهش میزان pH باران اسیدی تا 4، به­طور معنی­داری افزایش نیافت، ولی در 3 =pH افزایش معنی­داری یافت. نشت یونی در

شکل 1- اثر باران اسیدی در pHهای مختلف بر میزان نشت یونی برگ­های افرای پلت، میانگین­های دارای حروف مشترک بر اساس آزمون توکی در سطح احتمال یک درصد غیر معنی­دار هستند.

شکل 2- اثر باران اسیدی در pHهای مختلف بر میزان مالون­دی­آلدهید برگ­های افرای پلت، میانگین­های دارای حروف مشترک بر اساس آزمون توکی در سطح احتمال یک درصد غیر معنی­دار هستند.

گیاهان مواجه­شده با باران اسیدی دارای 3 =pH نسبت به گیاهان شاهد افزایش چشمگیری داشت و از نظر آماری تفاوت آن­ها معنی دار بود (شکل 1). این شاخص میزان آسیب­دیدگی به غشا را نشان می­دهد و رابطه­ی معکوسی با پایداری غشا دارد.    

کاهش pH باران اسیدی تا 4، تأثیری بر میزان پراکسیداسیون لیپید غشا نداشت و آن را در سطح تقریبا یکسانی با گیاهان شاهد نگه داشت. تنها گیاهان مواجه­شده با باران اسیدی 3 =pH افزایش معنی­داری در میزان پراکسیداسیون لیپید نشان دادند، به­طوری که افزایش میزان پراکسیداسیون لیپید در این گیاهان نسبت به گیاهان شاهد قابل ملاحظه بود (شکل 2). میزان مالون­دی­آلدئید شاخصی برای اندازه­گیری پراکسیداسیون لیپید غشا است و رابطه مستقیمی با آن دارد.

میزان کلروفیل کل: همان­طور که شکل 4 نشان می­دهد، در میزان کلروفیل کل با کاهش اسیدیته­ی باران تا 4 =pH تغییر معنی­داری مشاهده نشد، ولی در برابر باران اسیدی با 3 =pH کاهش معنی­داری در کلروفیل کل دیده شد. میزان کلروفیل کل در گیاهان مواجه­شده با باران اسیدی دارای 3 =pH نسبت به گیاهان شاهد به میزان زیادی کاهش یافت (شکل 3).

میزان فعالیت آنزیم­های سوپراکسیددیسموتاز، پراکسیداز و آسکوربات­پراکسیداز: مقایسه میانگین اثر باران اسیدی بر میزان فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز از روش توکی معنی­دار نبود ولی بر میزان فعالیت آنزیم­های پراکسیداز و آسکوربات­پراکسیداز در سطح احتمال 1 درصد معنی­دار بود. با کاهش میزان اسیدیته در باران اسیدی تا 4 =pH میزان فعالیت آنزیم های پراکسیداز و آسکوربات­پراکسیداز نسبت به گیاه شاهد

شکل 3- اثر باران اسیدی در pHهای مختلف بر میزان کلروفیل کل برگ­های افرای پلت، میانگین­های دارای حروف مشترک بر اساس آزمون توکی در سطح احتمال یک درصد غیر معنی­دار هستند.

شکل 4- اثر باران اسیدی در pHهای مختلف بر میزان فعالیت پراکسیداز برگ­های افرای پلت، میانگین­های دارای حروف مشترک بر اساس آزمون توکی در سطح احتمال یک درصد غیر معنی­دار هستند.

شکل 5- اثر باران اسیدی در pH های مختلف بر میزان فعالیت آسکوربات­پراکسیداز برگ­های افرای پلت، میانگین­های دارای حروف مشترک بر اساس آزمون توکی در سطح احتمال یک درصد غیر معنی­دار هستند

افزایش یافتند. میزان فعالیت پراکسیداز و آسکوربات­پراکسیداز در گیاهان تیمارشده با باران اسیدی دارای 3 =pH نسبت به گیاهان تیمارشده با باران اسیدی دارای 4 =pH کمتر بودند، ولی نسبت به گیاهان شاهد تغییر معنی­داری نکردند (به ترتیب شکل 4 و 5).  

تأثیر ریخت­شناسی باران اسیدی بر برگ­های افرای پلت: برگ­های افرای پلت توانستند در برابر باران اسیدی تا 4 =pH سالم و بدون تغییر باقی بمانند ولی باران اسیدی با 3 =pH

شکل 6- سمت راست: گیاه افرای پلت شاهد (تیمارشده با باران 6 = pH)، سمت چپ: برگ­های افرای پلت مواجه­ شده با باران اسیدی 3 = pH.

باعث آسیب جدی و بارز بر برگ­ها شد. آسیب­ها شامل بافت مردگی (necrosis) و خمیدگی حاشیه برگ بود (شکل 6).

بحث:

در این پژوهش، بروز لکه­های نکروزه بر روی برگ­های درخت افرای پلت (A. velutinum Boiss) تنها در گیاهان مواجه­شده با باران اسیدی 3 =pH، مشاهده شد. بنابر مطالعات میکرومورفولوژی برگی انجام­گرفته توسط Bruno و همکاران (2006)، منافذ روزنه­ای در درخت گرمسیری جنیپا
(Genipa americana L.) پس از مواجه­شدن با باران اسیدی شبیه­سازی شده، شکل طبیعی خود را از دست داده و لبه­ی بیرونی روزنه ها از هم گسیخته شدند. کاهش استحکام در یاخته­های جانبی سلول­های نگهبان روزنه و تغییر در تراوایی این یاخته­ها نیز توسط آن­ها گزارش گردید. افزون بر این، بافت­مردگی ناشی از باران اسیدی در برگ­های عنبر سائل توسط Chen و همکاران (2013) و در خیار توسط Wyrwicka و Skłodowska (2006) گزارش شده است. خمیدگی حاشیه برگ­ها و نکروزه شدن در گیاهان آبوتیلون
(Abutilon theophrasti Medik.) در 5/2 =pH نیز گزارش گردیده است (Mersie and Foy, 1986). وجود لکه­های نکروزه در پژوهش حاضر را می­توان به پاره شدن غشا و از بین رفتن یاخته­ها به­خاطر آسیب واردآمده­ به آن­ها توسط رادیکال­های آزاد اکسیژن (ROS) برانگیخته­شده توسط تنش باران اسیدی، نسبت داد. در حقیقت، باران اسیدی به عنوان یک تنش غیرزیستی سطوح ROS را در بافت­های گیاهی بالا می­برد (Kong et al., 2000; Velikova et al., 2000; Gabara et al., 2003). سطوح بالای ROS برای یاختههای گیاهی بسیار خطرناک بوده و به غشاها، پروتئین­ها و DNA آسیب وارد می­کند. ROS­ها در گیاهان برنج مواجه­شده با باران اسیدی نیز باعث نکروزه شدن برگ­ها شده است (Wang et al., 2014). همچنین ROS ها اصلی­ترین عامل برای مرگ بسیاری از گیاهان مواجه­شده با تنش­های سخت محیطی هستند
(Del Río et al., 2002).

پراکسیداسیون لیپید واکنشی است که در آن ترکیبات لیپوئیدی غشا از هم متلاشی می­گردد. پراکسیداسیون لیپید در غشا زمانی رخ می­دهد که سطوح ROS به حد آستانه خود رسیده باشد (Montillet et al., 2005). افزایش پراکسیداسیون لیپید در برگ­های افرا پس از مواجه­شدن با باران اسیدی نشان دهنده­ی میزان آسیب­دیدن گیاه است. Chen و همکاران (2014) گزارش کردند که در درختان سپیدار مواجه­شده با تنش شوری، افزایش میزان پراکسیداسیون لیپید ناشی از افزایش تولید ROS­ها است. همچنین Christou و همکاران (2014) دریافتند که تنش­های محیطی در توت­فرنگی به واسطه­ی تولید گونه­های واکنش­پذیر اکسیژن در سلول­ها باعث آسیب به بخش­های مختلف از جمله لیپیدهای غشایی می­شوند. بنابراین به­نظر می­رسد که آسیب واردآمده به غشای یاخته­ها در برگ های افرای پلت در نتیجه تنش اکسیداتیو ناشی از باران اسیدی باشد. افرای پلت توانست تا 4 =pH باران مقاومت نشان دهد و هیچگونه رنگ­پریدگی در برگ­ها ظاهر نشود، اما در 3 =pH تخریب کلروفیل به­طور چشمگیری صورت گرفته است. کاهش میزان کلروفیل در گیاهان آبوتیلون
(Abutilon theophrasti Medik.) (Mersie and Foy, 1986) و خیار (Cucumis sativus) (Wyrwicka and Skłodowska, 2006) و در درخت عنبر سائل (Liquidambar formosana) و شیما (Schima superba) (Chen et al., 2013) بسیار وابسته به میزان pH باران اسیدی بکاررفته بود، به­گونه­ای که با کم کردن pH میزان کلروفیل در برگ­ها کاهش یافت.

فعالیت آنزیم سوپراکسیدیسموتاز در برگ­های افرا به­طور معنی­داری تحت تأثیر باران اسیدی قرار نگرفت. برعکس، فعالیت پراکسیداز و آسکوربات­پراکسیداز با افزایش اسیدیته باران افزایش یافتند. ولی ضمن مواجهه با باران اسیدی 3 =pH بسیار کاهش یافتند. میزان آسکوربات­پراکسیداز بالا را می­توان یکی دیگر از علت­های اصلی سالم ماندن برگ­ها در مقابل باران اسیدی با pH پایین ذکر کرد. بنابر گزارش Kavitha و همکاران (2008) تنش اکسیداتیو موجب افزایش در نسخه برداری آسکوربات­پراکسیداز در برگ­های Avicennia marina می­شود. آن­ها همچنین بیان نمودند که فعالیت آسکوربات پراکسیداز در برگ­های A. marina نقشی در کاستن اثرات زیان­بار تنش اکسیداتیو دارد. گذشته از این­ها، بیان ژن­های آسکوربات­پراکسیداز به­خاطر آلودگی هوا توسط Kubo و همکاران (1995) و Rao و همکاران (1996) گزارش گردیده است. همچنین Bueno و Piqueras (2002) ثابت کردند که آسکوربات­پراکسیداز از یاخته­های تنباکو در برابر H₂O₂ تحت شرایط تنش­زا محافظت می­کند. نقش آسکوربات­پراکسیداز در حذف ROS از یاخته­های Euphorbia esula L. در پاسخ به تنش­های محیطی از جمله شوری، خشکی و سمیت عناصر نیز توسط Davis و Swanson (2001) گزارش شده است. افزون بر این، مشخص شده است که آسکوربات­پراکسیداز یکی از عوامل مهم پاکسازی و حذف ازن و ROSهای برگرفته­شده از ازن در آپوپلاست می­باشد (Chameides, 1989). اخیراً نقش آسکوربات­پراکسیداز پروکسی­زومی در ایجاد مقاومت به تنش­های محیطی از طریق کاهش تجمع H₂O₂ در گیاه آرابیدوپسیس تراریخته­شده به اثبات رسیده است (Guan et al., 2015). بنابر نتایج به­دست­آمده از این پژوهش، احتمال می­رود آسکوربات­پراکسیداز و پراکسیداز نقش مهمی در محافظت گیاه در برابر باران اسیدی داشته باشد.

نتیجه­گیری کلی:

طبق این پژوهش میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در pH آسیب­زننده بسیار کاهش یافت و آسیب­های ظاهری بروز پیدا کرد. درخت افرای پلت به­خوبی توانست در برابر پایین آوردن شدت اسیدیته باران اسیدی تا 4 =pH مقاومت کند و ظاهر خود را حفظ نماید اما در برابر باران اسیدی با 3 =pH حساسیت نشان داد و آسیب دید. طبق نتایج این تحقیق، درخت افرای پلت را می­توان در مناطقی که میزان اسیدیته باران اسیدی تا 4= pH هم می­رسد پرورش داد. روی هم­رفته، پژوهش­های گسترده­ای لازم است تا مکانیسم دقیق اثر باران اسیدی و سیستم­های مقاومت گیاهان را در برابر باران­های اسیدی مشخص نماید.

منابع:

Athar, H. R., Khan, A. and Ashraf, M. (2008) Exogenously applied ascorbic acid alleviates salt-induced oxidative stress in wheat. Environmental and Experimental Botany 63: 224-231.

Bear, F. (1964) Chemistry of the Soil. Reinhold Publisher Corp., New York, second edition, 515 p.

Bellani, L. M., Rinallo, C. Muccifora, S. and Gori, P. (1997) Effect of simulated acid rain on pollen physiology and ultrastructure in the apple. Environmental Pollution 95: 357-362.

Botkin, D. B. and Keller, A. (2003) Environmental Science, 4th Ed. John Wiley and Sons, USA, pp.485-519.

Bouwman, A. F., Van Vuuren, D. P., Derwent, R. G. and Posch, M. (2002) A global analysis of acidification and eutrophication of terrestrial ecosystems. Water Air Soil Pollution 141: 349–382.

Bruno F. S., Silva, L. C., Azevedo, A. A. and Aguiar, R. (2006) Effects of simulated acid rain on leaf anatomy and micromorphology of Genipa americana L. (Rubiaceae). Brazilian Archives Biology and Technology 49: 313-321.

Bueno, P. and Piqueras, A. (2002) Effect of transition metals on stress, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in tobacco cell cultures. Plant Growth Regulation 36: 161–167.

Chameides, W. L. (1989) The chemistry of ozone deposition to plant leaves: Role of ascorbic acid, Environmental Science Technology 23: 595–600.

Chen, J., Wang, W., Liu, T., Wu, F. and Zheng, H. (2013) Photosynthetic and antioxidant responses of Liquidambar formosana and Schima superba seedlings to sulfuric-rich and nitric-rich simulated acid rain. Plant Physiology and Biochemistry
64: 41-51.

Chen, S., Hawighorst, P., Sun, J. and Polle, A. (2014) Salt tolerance in Populus: Significance of stress signaling networks, mycorrhization, and soil amendments for cellular and whole-plant nutrition. Environmental and Experimental Botany
107: 113-124. 

Christou, A., Manganaris, G. A., and Fotopoulos V. (2014) Systemic mitigation of salt stress by hydrogen peroxide and sodium nitroprusside in strawberry plant via transcriptional regulation of enzymatic and non-enzymatic antioxidants. Environmental and Experimental Botany
107: 46-54.

Davis, D. G. and Swanson, H. R. (2001) Activity of stress-related enzymes in the perennial weed leafy spurge (Euphorbia esula L.). Environmental and Experimental Botany 46: 95–108.

De Azevedo Neto, A. D., Prisco, J. T., Eneas-Filho, J., De Abreu, C. E. B. and Gomes-Filho, E. (2006) Effect of salt stress on antioxidative enzymes and lipid peroxidation in leaves and roots of salt-tolerant and salt-sensitive maize genotypes. Environmental and Experimental Botany 56:87-94.

Del Río, L. A., Corpas, F. J., Sandalio, L. M., Palma, J. M., Gómez, M. and Barroso, J. B. (2002) Reactive oxygen species, antioxidant systems and nitric oxide in peroxisomes. Journal of Experimental Botany 53: 1255-1272.

Dionisio-Sese, M.L. and Tobita, S. (1998) Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress. Plant Science 135:1-9.

Gabara, B., Skłodowska, M., Wyrwicka, A., Gli´nska, S. and Gapi´nska, M. (2003) Changes in the ultrastructure of chloroplasts and mitochondria and antioxidant enzyme activity in Lycopersicon esculentum Mill. leaves sprayed with acid rain. Plant Science 164: 507–516.

Giannopolitis, C. N. and Ries, S. K. (1977) Superoxide dismutases. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiology 59: 309-314.

Guan, Q., Wang, Z., Wang, X., Takano, T. and Liu, S. (2015) A peroxisomal APX from Puccinellia tenuiflora improves the abiotic stress tolerance of transgenic Arabidopsis thaliana through decreasing of H₂O₂ accumulation. Plant Physiology 175:
183-191. 

Heath, R.L. and Packer, L. (1968) Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stochiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics 125: 189-198.

Kavitha, K., Venkataraman, G. and Parida, A. (2008) An oxidative and salinity stress induced peroxisomal ascorbate peroxidase from Avicennia marina: Molecular and functional characterization. Plant Physiology and Biochemistry 46: 794-804.

King, H. B., Wang, M. K., Zhuang, S. Y., Hwong, J. L., Liu, C. P. and Kang, M. J. (2006) Sorption of sulfate and retention of cations in forest soils of Lien-Hua-Chi watershed in central Taiwan. Geoderma 13: 143-153.

Kita, I., Sato, T., Kase, Y. and Mitropoulos, P. (2004) Neutral rains at Athens, Greece: a natural safeguard against acidification of rains. Science of the Total Environment 327: 285-294.

Kong, F. X., Liu, Y., Hu, W., Shen, P. P., Zhou, C. L. and Wang, L. S. (2000) Biochemical responses of the mycorrhizae in Pinus massoniana to combined effects of Al, Ca and low pH. Chemosphere
 40: 311-318.

Kubo, A., Saji, H., Tanaka, K. and Kondo, N. (1995) Expression of Arabidopsis cytosolic ascorbate peroxidase gene in response to ozone or sulfur dioxide. Plant Molecular Biology 29: 479–489.

Kumar, A. J., Gough, W. A., Karagatzides, J. D., Bolton, K. A. and Tsuji, L. J. S. (2001) Testing the validity of a critical sulphur and nitrogen load model in Southern Ont., Canada, using soil chemistry data from MARYP. Environmental Monitoring and Assessment 69: 221–230.

Mersie, W. and Foy, C. L. (1986) Effects of acidity of simulated acid rain and its influence on the phytotoxicity of chlorsulfuron on velvetleaf and barly. Environmental and Experimental Botany 26: 341-347.

Montillet, J. L., Chamnongpol, S. C., Rustérucci, J., Dat, B., van de Cotte, J. P., Agnel, C., Battesti, D., Inzé, F., Van, B. and Triantaphylides, C. (2005) Fatty acid hydroperoxides and H₂O₂ in the execution of hypersensitive cell death in tobacco leaves. Plant Physiology 138: 1516-1526.

Nakano, Y. and Asada, K. (1981) Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidases in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiology 22:
867–880.

Noctor, G. and Foyer, C. H. (1998) Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control. Plant Molecular Biology 49: 249-279.

Prihatin, J., Corebima, A.D. and Abdul Gofur A. (2015) The Effect of exposure of mulberry to acid rain on the defects cocoon of Bombyx mori L. Procedia Environmental Sciences 23: 186-191.

Rao, M.V, Paliyath. G. and Ormrod, D. P. (1996) Ultraviolet-B- and ozone induced biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thaliana. Plant Physiology 110: 125–136.

Seufert, G., Hoyer, V., Wollmer, H. and Arndt, U. (1990) The Hohenheim long-term experiment. General methods and materials. Environmental Pollution 68: 205–229.

Silva, L. C., Azevedo, A. A., Silva, E. A. M. and Oliva, M. A. (2005) Effects of simulated acid rain on the growth and anatomy of five Brazilian tree species. Australian Journal of Botany 53: 1-8.

Singh, J., Upadhyay, A.K., Prasad, K., Bahadur, A. and Rai, M. (2007) Variability of carotenes, vitamin C, E and phenolics in brassica vegetables. Journal of Food Composition and Analysis 20: 106-112.

Velikova, V., Yordanow, I. and Edreva, A. (2000) Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants. Protective role of exogenous polyamines. Plant Science 151: 59–66.

Wang, L., Wang, W., Zhou, Q. and Huang, X. (2014) Combined effects of lanthanum (III) chloride and acid rain on photosynthetic parameters in rice. Chemosphere 112: 355-361.

Wen, K., Liang, C., Wang, L., Hu, G. and Zhou, Q. (2011) Combined effects of lanthanumion and acid rain on growth, photosynthesis and chloroplast ultrastructure in soybean seedlings. Chemosphere 84: 601-608.

Wiersema, J. H. and Blanca, L. (1999) World Economic plants: A standard Reference. CRC press. New York P. 792.

Wu, Q. and Han, G. (2015) Sulfur isotope and chemical composition of the rainwater at the Three Gorges Reservoir. Atmospheric Research 155: 130-140.

Wyrwicka, A. and Skłodowska, M. (2006) Influence of repeated acid rain treatment on antioxidative enzyme activities and on lipid peroxidation in cucumber leaves. Environmental and Experimental Botany 56: 198-204.

Zhang, J. E., Ouyang, Y. and Ling, D. J. (2007) Impact of simulated acid rain on cation leaching from the Latosol in south China. Chemospher 67: 2131-2137.