فرآیند و کارکرد گیاهی

تاثیر پاکلوبوترازول و تلقیح قارچ Piriformospora indica بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و صفات مورفولوژیک گیاه لوبیا سبز (Phaseoluse vulgaris L.) تحت تنش سرما

معصومه علی­زاده فروتن¹، همت­اله پیردشتی^*2، یاسر یعقوبیان² و ولی­اله بابایی­زاد³

¹ گروه زراعت، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ² گروه زراعت، پژوهشکده ژنتیک و زیست­فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ³ گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

 (تاریخ دریافت: 26/08/93، تاریخ پذیرش نهایی: 02/02/1394)

چکیده:

به منظور بررسی اثر قارچ اندوفیت Piriformospora indica و پاکلوبوترازول در القای تحمل به تنش سرما در گیاه لوبیا سبز (Phaseolus vulgaris L.)، آزمایشی گلخانه­ای در سال 1392 و در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری به­صورت فاکتوریل بر پایه­ طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار، اجرا شد. تیمارهای آزمایشی شامل سه سطح تنش سرما (شاهد، سه روز و شش روز تنش سرمای 5 درجه سانتی­گراد)، دو سطح تلقیح قارچی (بدون تلقیح و تلقیح قارچ P. indica) و سه سطح پاکلوبوترازول (صفر، 40 و 80 میلی­گرم در لیتر) بود. تلقیح قارچ در مرحله­ی کاشت، محلول­پاشی پاکلوبوترازول در دو مرحله­ی پنج و شش هفته پس از کاشت و تنش سرما هشت هفته پس از کاشت اعمال گردید و صفات مورفولوژیک، محتوای نسبی آب برگ (RWC) و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی کاتالاز (CAT) و پراکسیداز (POD) اندازه­گیری شد. نتایج نشان داد که اعمال تنش سرما به­ویژه تنش شش روز سبب کاهش صفات طول ساقه، RWC و فعالیت POD گردید ولی افزایش حدود 3/2 برابری فعالیت CAT را در پی داشت. تلقیح قارچ P. indica در تنش سرمای شش روز افزایش 8 درصدی تعداد گره و همچنین در تنش سه و شش روز، افزایش میزان RWC (به ترتیب حدود 3 و 11 درصد) و فعالیت CAT (به ترتیب 16/2 برابر و 34 درصد) را در پی داشت. در تمام سطوح تنش سرما، محلول­پاشی با غلظت 80 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول باعث افزایش فعالیت CAT (به ترتیب 50، 159 و 87 درصد) گردید. در مجموع نتایج به دست آمده از این پژوهش نشان­دهنده­ی نقش مثبت قارچ P. indica و پاکلوبوترازول بر بهبود رشد و افزایش مقاومت گیاه لوبیا سبز نسبت به تنش سرما می­باشد.

 واژه­های کلیدی: آنزیم­های آنتی­اکسیدانی، پاکلوبوترازول، قارچ اندوفیت، لوبیا سبز، Piriformospora indica.

مقدمه:

گیاهان همواره در معرض طیف وسیعی از تنش­های زیستی و غیر­زیستی قرار دارند که  امروزه به یک مشکل جهانی و زیست­محیطی تبدیل شده است (Knight and Knight, 2001; Adya et al., 2013). دمای پایین نیز یک عامل زیست­محیطی مهم است که بر رشد، زنده­مانی و گسترش جغرافیایی گیاهان فشار شدیدی وارد می­کند و تولیدات کشاورزی را کاهش می­دهد. این تنش می­تواند سرعت فرآیندهای بیوشیمیایی سلول­ها را تحت تأثیر قرار داده و منجر به ایجاد عدم تعادل در فرآیندهای اصلی مسیرهای متابولیک ­شود (پائیزی و شریعتی، 1390؛ Jan et al., 2009). بررسی عوامل دخیل در خسارت سلولی نشان می­دهد که ایجاد گونه­های اکسیژن فعال به عنوان یکی از عوامل تخریب، سبب تغییر عوامل دخیل در حفظ ترکیبات غشایی، ترکیبات ضدانجماد، آنتی­اکسیدان­ها و فرآیندهای بسیار دیگری می­گردد (Cao et al., 2010). میزان مقاومت در برابر تنش اکسیداتیو نیز بستگی به فعالیت مکانیسم­های دفاعی دارد، این مکانیسم­ها می­توانند با جمع آوری انواع اکسیژن فعال و ترمیم نقاط صدمه دیده، تنش اکسیداتیو را کاهش داده و گیاه را به شرایط مطلوب برسانند (Jubany-Mari et al., 2010). هرچند در شرایط عادی نیز رادیکال­های آزاد اکسیژن تولید می­شوند، اما به هنگام تنش، تجمع ردوکتانت­ها در سیستم چرخه­ی انتقال الکترون فتوسنتزی، سبب تولید مقدار زیادی از رادیکال­های آزاد اکسیژن مانند اکسیژن نوزاد، سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و سایر رادیکال­های هیدروکسیل می­گردد که این رادیکال­ها با اجزا و ترکیب­های سلولی چون لیپیدها، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک واکنش نشان داده و منجر به پراکسیداسیون غشا، تخریب پروتئین­ها و جهش در مولکول­های DNA می­گردند (Modarresi et al., 2012; Zhu et al., 2009).

به طور کلی تولید محصولات کشاورزی به­ویژه در شرایط وجود تنش­های محیطی، نیازمند برنامه­ریزی و اقدامات راهبردی دقیق است تا میزان تولید این محصولات پاسخگوی نیازهای جمعیت روبه رشد جهان باشد. یک راهکار ممکن در این زمینه، بهره­برداری از همزیستی میکوریزایی برای تحریک رشد گیاه به­ویژه در شرایط تنش­زا می­باشد (Adya et al., 2013). قارچ Piriformospora indica نیز رابطه همزیستی با گیاهان داشته و در افزایش تحمل به تنش­های محیطی مؤثر واقع می­گردد (کاری ­دولت­آبادی و همکاران، 1391). قارچ P. indica یک شبه­میکوریزا است که رفتار قارچ­های میکوریزا را در همزیستی با گیاهان تقلید می­کند. این قارچ برای اولین بار در سال 1998 به وسیله­ی ورما و همکاران
(Verma et al., 1998) از ریزوسفر درختچه­های چوبی کهور (Prosopis juliflora) و کنار (Zizyphus numalaria) در بیابان تار (Thar) که در بخش غربی ایالت راجستان در شبه قاره­ی هند واقع است، جداسازی شده و به عنوان یک شبه­میکوریزای قابل کشت معرفی گردید. نتایج تحقیقات نشان داده است که تلقیح طیف گسترده­ای از گیاهان با P. indica اثر مثبتی روی زیست­توده تولیدی گذاشته و اثرات فیزیولوژیکی متعددی مانند افزایش گلدهی، افزایش عملکرد، بهبود تغذیه­ای گیاه و ایجاد تغییرات سیستمیکی (آمادگی دفاعی) وابسته به فعالیت مکانیسم­های آنتی­اکسیدانی در پی دارد. این اثرات سبب افزایش رشد و تحمل گیاه به تنش­های زیستی و غیرزیستی می­گردد (Waller et al., 2005; Deshmukh et al., 2006; Druege et al., 2007 ).

از سوی دیگر، پاکلوبوترازول که عضوی از گروه مهار کننده­های رشد یعنی تریازول­ها است نیز سبب افزایش مقاومت گونه­های مختلف گیاهی به تنش­های زیستی و غیرزیستی از جمله بیماری­های قارچی، خشکسالی، آلودگی هوا و تنش دمای بالا و پایین نیز می­شود (Baninasab, 2009; Davis and Curry, 1991). پاکلوبوترازول تنظیم کننده­ی بیوسنتز جیبرلین است و اکسیداسیون کائورن به کائورنیک اسید (Kaurenic Acid) که به وسیله­ی کائورن اکسیداز انجام می­شود را مهار می­کند (رضوی­زاده و عمو­بیگی، 1392). همچنین این ترکیب، سبب تغییر در توازن هورمون­های آبسیزیک­ اسید (ABA)، سیتوکینین (CK) و اتیلن می­گردد (جعفری و همکاران، 1385). در حقیقت پاکلوبوترازول با کاهش آسیب­های اکسیداتیو ناشی از تنش­های محیطی از طریق افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی، از گیاهان محافظت می­کند (Lin et al., 2006).

جنس Phaseolus در سراسر جهان پراکنده است. گیاهان این جنس در مناطق گرمسیری، نیمه­گرمسیری و معتدل کشت می­شوند. از بین 30 گونه­ی شناخته شده­ی این جنس، فقط چهار گونه زراعی است که لوبیا سبز (Phaseolus vulgaris L.) مهم­ترین آنهاست. لوبیا در بین انواع گیاهان تجارتی دارای بیشترین میزان پروتئین بوده (باقری و همکاران،1380؛ نصری و خلعتبری، 1390) و از جمله محصولاتی است که می­توان در زمان­های مختلف (بهار، تابستان و پاییز) به کشت آن در مازندران اقدام کرد (متقیان و همکاران، 1388). بنابراین با توجه به زمان­های متفاوت کشت این گیاه، احتمال مواجه شدن آن با سرمای بهاره یا پاییزه وجود دارد. از این­رو، با توجه به موارد مطرح شده، این پژوهش با هدف بررسی میزان اثربخشی همزمان تلقیح قارچ P. indica و محلول­پاشی پاکلوبوترازول بر افزایش تحمل به تنش سرمازدگی در گیاه لوبیا سبز اجرا شد.

مواد و روش­ها:

این آزمایش در بهار 1392 در گلخانه­ی تحقیقاتی پژوهشکده­ی ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان واقع در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری به­صورت فاکتوریل برپایه­ی طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار اجرا شد. تیمارهای آزمایشی شامل دو سطح عدم تلقیح و تلقیح با قارچ Pirifomospora indica ، سه سطح پاکلوبوترازول (صفر، 40 و 80 میلی­گرم در لیتر) و سه سطح تنش سرما (شاهد، سه روز و شش روز در دمای 5 درجه سانتی­گراد) بود. خاک مورد استفاده در این پژوهش از عمق 30-0 سانتی­متری مزرعه­ی تحقیقاتی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری تهیه شده و پس از الک کردن با نسبت 1:2 با ماسه شسته مخلوط گردید. به­منظور افزایش دقت آزمایش و بررسی دقیق­تر اثر قارچ P. indica، خاک مورد استفاده به مدت یک ساعت در اتو­کلاو با دمای 121 درجه­ی سانتی­گراد استریل شد. اطلاعات خاک مورد استفاده در پژوهش، در جدول 1 آورده شده است.

سویه­ی قارچ P. indica از مجموعه­ی قارچ­های زنده آزمایشگاه قارچ­شناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری تهیه و پس از کشت در محیط کشت کفر (Kaefer, 1977)، به مدت چهار هفته در دمای 25 درجه­ی سانتی­گراد نگهداری و پس از اسپورزایی، اسپورهای قارچی از محیط کشت جدا­سازی و پس از رساندن به غلظت 10⁵×5 اسپور در میلی­لیتر برای تلقیح بذرهای لوبیا سبز رقم سان ری (Sunray) استفاده شد. قبل از تلقیح، بذرها با هیپوکلریت سدیم یک درصد به مدت 20 دقیقه ضد­عفونی و چند بار با آب مقطر شستشو شدند (Blee and Anderson, 1996). سپس بذرها به مدت سه روز در ژرمیناتور با دمای 28 درجه سانتی­گراد جوانه­دار گردید. بذرهای جوانه­دار به دو قسمت تقسیم و برای یکسان­سازی شرایط تلقیح، نیمی از بذرها درون بشر حاوی 500 میلی­لیتر سوسپانسیون اسپور قارچی و نیم دیگر درون بشر حاوی 500 میلی­لیتر محلول آب-تویین یک در هزار غوطه­ور شده و به مدت 4 ساعت روی شیکر با سرعت 80 دور در دقیقه قرار گرفتند. تعداد 12 عدد بذر در عمق 2 سانتی­متری خاک گلدان­های پلاستیکی با گنجایش دو کیلوگرم خاک کشت گردید و بوته­ها در دو مرحله­ی دو هفته و چهار هفته پس از کاشت تنک شده و به 6 بوته در هر گلدان کاهش یافت.

محلول­پاشی پاکلوبوترازول در دو مرحله و طی هفته­های پنجم و ششم پس از کاشت صورت گرفت. برای تیمار صفر میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول نیز به منظور یکسان­سازی شرایط تیماری از آب مقطر استفاده گردید. هشت هفته پس از کاشت و دو هفته پس از دومین محلول­­پاشی، دو سوم گلدان­ها برای اعمال تنش سرمازدگی به اتاقک رشد (مدل SPG30000، شرکت نور صنعت) با دمای 5 درجه سانتی­گراد منتقل شدند. پس از سه و شش روز تنش سرما گلدان­ها از اتاقک رشد خارج شده و پس از گذشت دوازده ساعت، سه بوته از هر گلدان جهت نمونه­برداری صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی انتخاب و نمونه­برداری از برگ­های بالای بوته­ها صورت گرفت. سه بوته باقی­مانده نیز برداشت شده و طول ساقه، ارتفاع بوته،  قطر ساقه، تعداد برگ در بوته و تعداد گره ساقه اندازه­گیری شد.

محتوای نسبی آب برگ: محتوای نسبی آب برگ با استفاده از روش ایریگوین و همکاران (Irigoyen et al., 1992) و با قرار دادن نمونه­های تازه برگی به مدت 24 ساعت در آب مقطر اندازه­گیری و با استفاده از رابطه 1 محاسبه گردید.

رابطه 1

در این رابطه  :F_wوزن تر برگ بلافاصله بعد از نمونه‎برداری، D_w: وزن خشک برگ بعد از قرار گرفتن در آون و S_w: وزن اشباع برگ بعد از قرار گرفتن در آب مقطر است.

اندازه­گیری آنزیم­ها: برای استخراج محلول­های آنزیمی کاتالاز و پراکسیداز، 5/0 گرم از نمونه برگی با استفاده از هاون چینی کاملا سرد و نیتروژن مایع همگن و سپس به آن 5 میلی لیتر بافر فسفات سرد (pH= 7.5) محتوی EDTA 5/0 میلی

مولار اضافه شد. همگن­ها پس از انتقال به لوله­های آزمایش، به مدت 15 دقیقه با دور 20000 در دقیقه و دمای 4 درجه سانتی­گراد، سانتریفیوژ شدند (Sairam et al., 2002).

فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس روش ابی (Aebi, 1984) اندازه­گیری شد. کمپلکس واکنشی شامل 5/1 میلی­لیتر از بافر پتاسیم فسفات 100 میلی­مولار (pH=7)، 5/0 میلی­لیتر پراکسید هیدروژن 5/7 میلی­مولار و 50 میکرولیتر از محلول آنزیمی می­باشد که حجم نمونه­ها با اضافه کردن آب مقطر به 3 میلی لیتر رسانده شد. با افزودن پراکسید هیدروژن واکنش آغاز می گردد و کاهش در جذب نمونه­ها در طول موج 240 نانومتر در مدت یک دقیقه ثبت گردید.

کمپلکس واکنشی آنزیم پراکسیداز (دو میلی­لیتر) شامل یک میلی­لیتر بافر فسفات 100 میلی­مولار (pH=7)، 250 میکرولیتر از EDTA 1/0 میلی­مولار، یک میلی­لیتر گایاکول 5 میلی­مولار، یک میلی­لیتر پراکسید هیدروژن 15 مولار و 50 میکرولیتر از محلول آنزیمی استخراج شده بود. واکنش با اضافه کردن محلول آنزیمی شروع شده و افزایش جذب در طول موج 470 نانومتر به مدت یک دقیقه ثبت شد (Tang and Newton, 2005).

میزان پروتئین موجود در نمونه­های آنزیمی استخراج شده، به روش بردفورد (Bradford, 1976) اندازه­گیری شد. کمپلکس واکنش شامل 100 میکرولیتر از محلول آنزیمی استخراج شده، 200 میکرولیتر معرف بردفورد و 700 میکرولیتر آب دیونیزه بود و جذب آنها در طول موج 595 نانومتر یادداشت شد.

آزمون نرمال بودن داده­ها با استفاده از نرم­افزار SPSS و روش کولموگروف-اسمیرنوف انجام گرفت. سپس داده­ها به روش تجزیه واریانس و به وسیله­ی نرم افزار آماری SAS نسخه 1/9 (SAS Institute, 2009) تجزیه و مقایسه­ی میانگین­ها با استفاده از آزمون حداقل اختلاف معنی­دار (LSD) در سطح احتمال پنج درصد انجام شد. برای رسم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده گردید.

نتایج و بحث:

صفات مورفولوژیک: بر اساس جدول تجزیه واریانس داده­های مربوط به صفات مورفولوژیک (جدول 2)، اثر ساده­ی تنش سرما بر تمام صفات اندازه­گیری شده به جز قطر ساقه، در سطح یک درصد معنی­دار شد. اثر همزیستی قارچی بر قطر ساقه، تعداد برگ در بوته و تعداد گره ساقه (01/0P≤) و همچنین اثر ساده­ی پاکلوبوترازول بر ارتفاع بوته (01/0P<)، تعداد برگ در بوته (05/0P<) و تعداد گره ساقه (01/0P<) معنی­دار بود. برهمکنش سرما و تلقیح قارچ بر صفات تعداد برگ در بوته (01/0P<) و تعداد گره ساقه (05/0P<) و برهمکنش سرما و پاکلوبوترازول بر ارتفاع بوته، قطر ساقه (01/0P<) و تعداد گره ساقه (05/0P<) اثر معنی­داری داشت، در حالی­که برهمکنش قارچ و پاکلوبوترازول بر هیچ­ یک از صفات اندازه­گیری شده معنی­دار نبود. برهمکنش سه گانه­ی سرما، قارچ و پاکلوبوترازول نیز بر صفات قطر ساقه (05/0P<) و تعداد برگ در بوته (01/0P<) اثر معنی­داری نشان داد.

بوته­های در معرض تنش سرمای سه روز، ساقه­های بلندتری نسبت به بوته­های شاهد (بدون تنش) داشتند درحالی که اعمال تنش شش روز سبب کاهش چشمگیر طول ساقه نسبت به شرایط شاهد و تنش سه روز سرمازدگی شد (شکل 1). در پژوهشی مشابه، کاهش رشد رویشی در گیاه گندم نیز در اثر تنش سرما گزارش شده است (Tobeh and Jamaati-e-Somarin, 2012). تنش سرما با تأثیر بر فعالیت­های فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و آسیب بافت­ها و سلول­ها سبب اختلال در تولید کلروفیل و کلروپلاست شده و در نتیجه بر فتوسنتز اثر منفی می­گذارد. همچنین فتوسنتز خالص گیاهان در تنش سرما کاهش می­یابد که به دلیل توقف جریان سیتوپلاسمی، کاهش انرژی در فتوسنتز

جدول 2- میانگین مربعات (MS) اثر سرما، قارچ و پاکلوبوترازول بر صفات مورفولوژیک لوبیا سبز.

^*و^** معنی­دار در سطح احتمال پنج و یک درصد. ns غیر معنی­دار.

شکل 1- اثر تنش سرما بر طول ساقه­ی لوبیا سبز. حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد است.

شکل 2- اثر همزیستی قارچی بر قطر ساقه (a) و اثر پاکلوبوترازول بر تعداد برگ در بوته (b) گیاه لوبیا سبز. حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد است.

و فراهم نبودن فسفات های سرشار از انرژی می­باشد و در نهایت منجر به کاهش رشد گیاه می­شود (کافی و همکاران، 1388).

تلقیح گیاه با قارچ P. indica افزایش قطر ساقه را به دنبال داشت. به­طوری­که، قطر ساقه­ی گیاهان تلقیح شده حدود 13 درصد بیشتر از گیاهان تلقیح نشده بود (شکل 2-a). کاربرد پاکلوبوترازول تعداد برگ را در گیاه لوبیا سبز به طور قابل ملاحظه­ای افزایش داد. بر اساس شکل 2-b در غلظت 80 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول بیشترین تعداد برگ مشاهده شد که نسبت به غلظت صفر آن حدود 12 درصد افزایش داشت. گزارش­های گوناگونی از اثر پاکلوبوترازول بر تعداد برگ در بوته وجود دارد به طوری­که حجتی و همکاران (1389) در کوکب کوهی و Yeshitela و همکاران (2004) در گیاه انبه کاهش تعداد برگ در اثر کاربرد پاکلوبوترازول را گزارش کردند که برخلاف نتایج پژوهش حاضر است. همچنین در آزمایشی که روی توت­فرنگی رقم سلوا انجام شد، تعداد برگ ها تحت تأثیر پاکلوبوترازول قرار نگرفت (شاکری و همکاران، 1388). به نظر می­رسد اثر پاکلوبوترازول بر تولید برگ­های جدید بستگی به غلظت مورد استفاده آن دارد. پاکلوبوترازول در غلظت­های بالا تولید برگ را کاهش می­دهد در حالی­که غلظت­های پایین، تعداد برگ را تحت تأثیر قرار نمی­دهد (Young, 1983). همچنین بین زمان کاربرد پاکلوبوترازول و ظهور علایم ناشی از آن در گیاه فاصله­ی زمانی وجود دارد که به عواملی چون زمان کاربرد، غلظت مورد استفاده، میزان تعرق، سرعت حرکت شیره­ی گیاهی و میزان جیبرلین درونی بستگی دارد (شاکری و همکاران، 1388).

بر اساس مقایسه میانگین انجام شده در هر دو تیمار تلقیح و بدون تلقیح با قارچ P. indica، تنش سرما کاهش تعداد برگ در بوته را به دنبال داشت. به­طوری­که در گیاهان بدون تلقیح قارچ، تنش سرمای شش روز و در گیاهان تلقیح شده، تنش سرمای سه روز بیشترین کاهش را (به ترتیب حدود 15 و 37 درصد) نسبت به شاهد نشان داد (جدول 3). به نظر می­رسد رشد کم یک حالت سازگاری برای زنده ماندن گیاه در شرایط تنش است، به دلیل این­که در این حالت موادغذایی و انرژی به جای استفاده در رشد شاخساره به سمت مولکول­های نگهداری کننده­ی گیاه در برابر تنش هدایت می­شود (Khalid, 2006).

تعداد گره در گیاهان بدون قارچ و با قارچ در شرایط بدون تنش سرما (شاهد) تفاوتی با هم نداشتند. با اعمال تنش سرمای سه روز، تعداد گره در گیاهان همزیست شده با قارچ حدود 25 درصد نسبت به گیاهان غیرهمزیست کاهش نشان داد اما در تنش شش روز، در گیاهان همزیست با قارچ سبب افزایش 8 درصدی در تعداد گره نسبت به گیاهان غیرهمزیست شد (جدول 3). قارچ P. indica از طریق تولید اکسین سبب افزایش طول ریشه و جذب بیشتر عناصر غذایی می­شود که نتیجه­ی آن بهبود رشد در قسمت­های هوایی گیاه است (کاری دولت­آبادی و همکاران، 1391).

در برهمکنش تنش سرما و پاکلوبوترازول (جدول 4)، در شرایط شاهد (بدون تنش) و تنش سرمای شش روز، محلول پاشی پاکلوبوترازول تعداد گره ساقه را به طور قابل­ملاحظه­ای افزایش داد، به­طوری­که این افزایش در تیمار بدون تنش سرما، برای غلظت­های 40 و 80 میلی­گرم در لیتر حدود 4 درصد و در تنش سرمای شش روز به ترتیب حدود 29 و 24 درصد بود. در تنش سرمای سه روز، کاربرد پاکلوبوترازول اثر معنی داری بر تعداد گره در بوته نداشت (جدول 4).

قطر ساقه و ارتفاع بوته گیاهان شاهد (بدون تنش سرما) و تنش سرمای سه روزه تحت تأثیر محلول­پاشی پاکلوبوترازول قرار نگرفت اما در تنش شش روز، کاربرد پاکلوبوترازول قطر ساقه­ و ارتفاع بوته­ی گیاهان را افزایش داد به طوری­که بیشترین افزایش مربوط به غلظت­ 40 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول بود که به ترتیب حدود 21 و 15 درصد در مقایسه با غلظت صفر آن افزایش داشت (جدول 4). شاکری و همکاران (1388) گزارش کردند که پس از محلول­پاشی پاکلوبوترازول طول دمبرگ در گیاه توت­فرنگی بر عکس قطر دمبرگ کاهش یافت. در مورد نقش پاکلوبوترازول بر پارامترهای رشد گزارش­های متعددی وجود دارد. از جمله گزارش شده که پاکلوبوترازول کاهش رشد ناشی از تنش سرما را بهبود بخشید (Pinhero and Fletcher, 1994). سرما به عنوان یک تنش اسمزی، جذب آب از ریشه­ی گیاه را محدود کرده و باعث افت پتانسیل آب و انتقال آب از سیمپلاست به آپوپلاست می­شود که نتیجه­ی آن کم آبی شدید است (محسن زاده و همکاران، 1389). با توجه به اینکه رشد و تقسیم سلولی نیازمند حفظ فشار تورژسانس می­باشد و سلول­ها باید حجم مناسبی برای تقسیم داشته باشند بنابراین به دنبال کمبود آب

جدول 3- مقایسه میانگین برهمکنش تنش سرما و قارچ بر تعداد برگ و تعداد گره در بوته­ی لوبیا سبز.

میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشابه در هر ستون بر اساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی­داری با یکدیگر ندارند.

جدول 4- مقایسه میانگین برهمکنش تنش سرما و پاکلوبوترازول بر صفات مورفولوژیک لوبیا سبز.

میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشابه در هر ستون بر اساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی­داری با یکدیگر ندارند.

و ایجاد تنش اسموتیک، با از دست رفتن آب سلول­ها، فشار تورژسانس و حجم سلول کاهش یافته و این امر موجب کاهش رشد و تقسیم سلولی می­گردد (Xing and Zhu, 2002).

صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی: نتایج حاصل از تجزیه واریانس اثر تیمارهای آزمایشی بر شاخص­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی (جدول 5) نشان داد که اثر تنش سرما بر محتوای نسبی آب برگ و فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود. اثر ساده­ی قارچP. indica بر محتوای نسبی آب برگ و فعالیت آنزیم کاتالاز در سطح یک درصد و همچنین اثر ساده­ی پاکلوبوترازول بر فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز (01/0P<) معنی­دار گردید.

برهمکنش تنش سرما و قارچ بر محتوای نسبی آب برگ (01/0P<) و فعالیت آنزیم­های کاتالاز (01/0P<) و پراکسیداز (05/0P<) معنی­دار گردید. همچنین برهمکنش تنش سرما و پاکلوبوترازول بر تمام صفات به جز پروتئین محلول اثر معنی داری (01/0P<) داشت ولی اثر متقابل قارچ و پاکلوبوترازول تنها بر محتوای نسبی آب برگ معنی­دار بود. برهمکنش سه گانه­ی تنش سرما، قارچ و پاکلوبوترازول نیز بر فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود (جدول 5).

بر اساس نتایج پژوهش حاضر، تنش سرمای سه و شش روزه در هر دو تیمار تلقیح و عدم تلقیح قارچ، محتوای نسبی آب برگ را نسبت به گیاهان شاهد (بدون تنش) به­صورت معنی­داری کاهش داد ولی میزان کاهش در دو تیمار قارچی متفاوت بود، به طوری­که در گیاهان تلقیح شده با P. indica کاهش کمتری نسبت به گیاهان تلقیح نشده ( به ترتیب حدود 7 و 17 درصد) مشاهده گردید (شکل 3).

جدول 5- میانگین مربعات (MS) اثر سرما، قارچ و پاکلوبوترازول بر صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی لوبیا سبز.

^*و^** معنی­دار در سطح احتمال پنج و یک درصد. ns غیر معنی­دار.

شکل 3- برهمکنش تنش سرما و قارچ بر محتوای نسبی آب برگ گیاه لوبیا سبز. حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد است.

گزارش­هایی در رابطه با کاهش محتوای نسبی آب برگ (RWC) تحت تنش دمای پایین در گیاهانی مانند ، چهار رقم گندم (محسن­زاده و همکاران، 1389) و دو گونه فسکیوی بلند (Festuca arundinacea Shcreb) و مرتعی
(Festuca pratensis Huds) (پارساییان و همکاران، 1385) ارایه شده است. با وجود اینکه P. indica از ریگزارهای گرم واقع در غرب راجستان هند جدا شده است، در دماهای پایین نیز در حضور میزبان­های علفی ویژگی­های منحصر به فردی را به نمایش می­گذارد که هنوز در منابع به­طور کامل به آن پرداخته نشده است (Varma et al., 2013)، اما بیان شده که همزیستی میکوریزایی اغلب منجر به تغییر سرعت حرکت آب در داخل و خارج گیاهان میزبان شده و بر آب­گیری بافت و فیزیولوژی برگ تأثیر می­گذارد (Auge et al., 2001). میسلیوم قارچ­ در خاک نقش مهمی در تأثیر قارچ بر رابطه آبی گیاه میزبان دارد و باعث جذب آب از منافذ بسیار ریز خاک می­شود (Bearden, 2001). این قارچ­ها احتمالاً از طریق تغییر در مورفولوژی ریشه و طویل کردن سیستم ریشه گیاه میزبان و افزایش سطح جذب از طریق ریسه­های قارچ، میزان آب بیشتری جذب کرده و باعث بهبود روابط آبی گیاه میزبان می­گردد (Auge et al., 2001). با توجه به این موارد، احتمال می­رود که افزایش محتوای نسبی آب برگ همزیستی با P. indica در تنش سرمازدگی در گیاه لوبیا سبز نیز به دلیل بهبود روابط آبی در این نوع همزیستی باشد.

در تنش سرمای سه روزه غلظت­های 40 و 80 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول محتوای نسبی آب برگ را نسبت به سطح صفر آن به طور قابل ملاحظه­ای افزایش داد. با این وجود، در تنش سرمای شش روز، تیمار پاکلوبوترازول اثر مثبتی بر محتوای نسبی آب برگ نداشت و حتی غلظت 80 میلی­گرم در لیتر آن  اثر کاهشی داشته و میزان RWC را نسبت به سطوح صفر و 40 میلی­گرم در لیتر کاهش داد. غلظت پایین پاکلوبوترازول (40 میلی­گرم در لیتر) بیشترین اثر را بر محتوای نسبی آب برگ داشت و غلظت 80 میلی­گرم در لیتر این ماده نتوانست اثر تخریبی تنش سرما را جبران کند (شکل 4).

در شرایط بدون تلقیح قارچ P. indica کاربرد غلظت 40 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول در محتوای نسبی آب برگ اثر چندانی نداشت و غلظت 80 میلی­گرم در لیتر سبب کاهش چهار درصدی آن گردید، ولی این روند در تلقیح قارچ
P. indica بر عکس بوده و افزایش میزان RWC را به دنبال داشت. در غلظت 80 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول تلقیح
 P. indica سبب افزایش 10 درصدی محتوای نسبی آب برگ نسبت به شرایط بدون تلقیح آن شد (شکل 5).

فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تأثیر تنش سرما و تلقیح قارچ P. indica قرار گرفت. اعمال تنش سه و شش روز سبب افزایش فعالیت این آنزیم گردید که بیشترین فعالیت آن در تنش شش روزه و با افزایش 3/2 برابری نسبت به تیمار شاهد مشاهده شد. در گیاهانی که به مدت سه و شش روز تحت تنش سرمای 5 درجه سانتی­گراد قرار داشتند، تلقیح قارچ P. indica فعالیت آنزیم کاتالاز را به طور معنی­داری افزایش داد که این افزایش برای تنش سه و شش روزه به ترتیب 16/2 برابر و 34 درصد بود ولی در گیاهان شاهد (بدون تنش سرما) تفاوت معنی­داری بین تیمار تلقیح و عدم تلقیح قارچ مشاهده نشد (شکل 6-a).

فعالیت آنزیم پراکسیداز برخلاف آنزیم کاتالاز، در اثر تنش سرما از روند کاهشی برخوردار بود به طوری­که با اعمال تنش سه روزه سرما کاهش فعالیت آن مشهود بود ولی با ادامه تنش تا شش روز افزایش فعالیت این آنزیم مشاهده شد هر چند در تنش شش روز نیز نسبت به شرایط شاهد، فعالیت کمتری داشت. در گروه شاهد (بدون تنش سرما) تلقیح قارچ با افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم پراکسیداز همراه بود که این افزایش نسبت به گیاهان تلقیح نشده حدود 14 درصد بود. اما در تنش سه و شش روز قارچ P. indica اثر معنی­داری بر فعالیت آنزیم مذکور نداشت (شکل 6-b).

گزارشی در مورد نقش P. indica در سیستم آنتی­اکسیدانی گیاه در تنش سرما وجود ندارد اما مطالعات اندکی در مورد افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و سایر آنتی­اکسیدان­ها در تنش­های خشکی و شوری در گیاهان همزیست شده با P. indica وجود دارد که می­توان به افزایش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی و میزان آسکوربیک­اسید در ریشه­ی جو تحت تنش شوری (Baltruschat et al., 2008)، افزایش فعالیت آنزیم­های پراکسیداز و کاتالاز در تنش خشکی (Sun et al., 2010; Kumar et al., 2009) و افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدانی در شرایط بروز بیماری­های گیاهی (Waller et al., 2005) اشاره کرد. 

گزارش شده که P. indica سبب افزایش مقاومت در برابر تنش­های غیرزیستی در گیاهان شده و افزایش رشد گیاه در شرایط تنش نیز در پی دارد (Kumari et al., 2003; Rai et al., 2001; Rai and Varma, 2005). P. indica سیستم دفاعی را تعدیل کرده و به منظور جبران خسارت به فتوسنتز و جلوگیری از آسیب اکسیداتیو ناشی از تنش، در متابولیسم گیاه تغییراتی ایجاد می­کند. همچنین یافته­ها حاکی از آن است که این قارچ سبب افزایش آنزیم­های آنتی­اکسیدانی متعددی شد که در سم­زدایی گونه­های اکسیژن فعال نقش دارند. این آنزیم­ها شامل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز، پراکسیداز (POD)، مونو دهیدروآسکوربات ردوکتاز (MDHAR) و دهیدرو ردوکتاز (DHAR) می­باشند. همچنین گزارش شده که P. indica سبب افزایش پاسخ­های ژنتیکی گیاه به تنش­ها می­شود که در بالا بردن مقاومت گیاهان زراعی به تنش­های غیرزیستی نقش دارد (Varma et al., 2013; Kumar et al., 2012).

گاهی در شرایط تنش ممکن است قدرت آنتی­اکسیدانی به منظور کاهش اثر آسیب­های اکسیداتیو کافی نباشد به همین دلیل کاهش فعالیت آنزیم گایاکول­پراکسیداز در اثر تنش سرما منطقی به نظر

شکل 4- برهمکنش تنش سرما و پاکلوبوترازول بر محتوای نسبی آب برگ گیاه لوبیا سبز. حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد است.

شکل 5- برهمکنش قارچ و پاکلوبوترازول بر محتوای نسبی آب برگ گیاه لوبیا سبز. حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد است.

شکل 6- برهمکنش سرما و قارچ بر فعالیت آنزیم­های کاتالاز (a) و پراکسیداز (b) برگ گیاه لوبیا سبز. حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد است.

می­رسد (شاهاندشتی و همکاران، 1390؛ سلطانی و همکاران، 1390).همچنین احتمال دارد کاهش آنزیم پراکسیداز و افزایش آنزیم کاتالاز در این آزمایش به دلیل کافی بودن فعالیت کاتالاز در حذف گونه­های فعال اکسیژن باشد. کاتالاز یکی از اجزای مهم سیستم آنتی­اکسیدانی است که هیدروژن پراکسید تولید شده از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز را تجزیه می­کند
 

شکل 7- برهمکنش تنش سرما و پاکلوبوترازول بر کاتالاز (a) و پراکسیداز (b) برگ گیاه لوبیا سبز. حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد است.

(Foyer et al., 1994; Pan et al., 2006; Zhu et al., 2009).

در گیاهان شاهد و تنش سه روز و شش روز با محلول پاشی غلظت­های 40 و 80 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول فعالیت  آنزیم کاتالاز ابتدا کاهش و سپس افزایش یافت. گیاهان محلول­پاشی شده با غلظت 80 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول از فعالیت آنزیمی بیشتری برخوردار بودند (شکل 7-a).

فعالیت آنزیم پراکسیداز پس از محلول­پاشی غلظت­های مختلف پاکلوبوترازول در گیاهان شاهد (بدون تنش سرما) افزایش تدریجی داشت به طوری­که این افزایش در غلظت 80 نسبت به غلظت 40 و صفر میلی­گرم در لیتر به ترتیب حدود 27 و 59 درصد بود. با افزودن غلظت 40 و 80 میلی­گرم در لیتر پاکلوبوترازول در تنش سه روز فعالیت آنزیم پراکسیداز نسبت به غلظت صفر میلی­گرم در لیتر افزایش یافت. همچنین در تنش شش روز با اضافه کردن پاکلوبوترازول ابتدا کاهش و سپس افزایش در فعالیت این آنزیم رخ داد که بین غلظت صفر و 80 میلی­گرم در لیتر تفاوت معنی­داری وجود نداشت (شکل 7-b).

افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز در این پژوهش با نتایج تنش سرما بر روی گیاه نخود که به وسیله­ی ونایی و همکاران (1390) گزارش شده است، همخوانی دارد. کاتالاز از شناخته شده­ترین آنزیم­های آنتی­اکسیدانی است که نقش مهمی در جمع­آوری پراکسید هیدروژن و کاهش اثرات تخریبی آن در پراکسی­زوم و گلی­اکسی­زوم و میتوکندری ایفا می­کند
 (Seckin et al,. 2010; Foyer and Nector, 2000). افزایش فعالیت کاتالاز در گیاهان سخت شده به سرما می­تواند به جلوگیری از آسیب­های ناشی از تنش کمک نماید، زیرا ممکن است سطوح سوپراکسید و مواد اکسیدشده­ی تک اکسیژنه در بافت سرما­زده افزایش یابد (کافی و مهدوی دامغانی، 1386). همچنین گزارش شده پاکلوبوترازول ممکن است اثرات تنش سرما را از طریق افزایش سطح آنزیم­های آنتی­اکسیدانی بهبود بخشد (Lin et al., 2006; Sankar et al., 2007).

نتیجه گیری کلی:

درمجموع می­توان بیان داشت که تلقیح قارچ P. indica و همچنین محلول­پاشی پاکلوبوترازول به میزان قابل توجهی شرایط نامساعد تنش سرمازدگی را بهبود بخشیده و سبب افزایش تحمل گیاه لوبیا سبز به این تنش گردید، که البته جهت تکمیل نتایج، پژوهش­های گلخانه­ای و مزرعه­ای بیشتری در این زمینه لازم است.

سپاسگزاری:

بدینوسیله از مساعدت­ها و حمایت­های مالی پژوهشکده­ی ژنتیک و زیست­ فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری قدردانی می­گردد.

منابع:

پائیزی، م. و شریعتی، م. (1390) بررسی اثر تنش دمای پایین بر عملکرد فتوسیستم II در جلبک Dunaliella salina با استفاده از کینتیک فلوئورسنس کلروفیل a. مجله سلول و بافت. 2(4): 405-395.

پارساییان، م.، میرلوحی، آ.، رضایی، ع. و خیام­نکویی، م. (1385) تأثیر قارچ­های اندوفایت بر خصوصیات فیزیولوژیکی و مقاومت به سرما در گونه فسکیوی مرتعی و فسکیوی بلند. مجله علوم و فنون کشاورزی و منابع طبیعی (علوم آب و خاک). 10: 211-197.

جعفری، ر.، منوچهری کلانتری، خ. و ترکزاده، م. (1385) بررسی اثرات پاکلوبوترازول بر افزایش مقاومت به سرما در نهال­های گوجه­فرنگی (Licopersicum esculentum L.). مجله­ی زیست­شناسی ایران 19: 298-290.

حجتی، م.، اعتمادی، ن.ا. و بانی­نسب، ب. (1389) اثر پاکلوبوترازول و سایکوسل بر رشد رویشی و گلدهی کوکب کوهی. فصلنامه علوم باغبانی (علوم و صنایع کشاورزی) 24 : 127-122.

رضوی­زاده، ر. و عموبیگی، م. (1392) تأثیر پاکلوبوترازول بر بهبود تحمل به خشکی در گیاهچه­های کلزا (Brassica napus L.) در شرایط کشت درون شیشه­ای (in vitro). فصلنامه فرآیند و کارکرد گیاهی 2: 34-21.

سلطانی­دلربا، ن. کرمیان، ر. رنجبر، م. (1390) اثر برهمکنش سالیسیلیک ­اسید و تنش سرما بر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان در گیاه شیرین بیان (Glycyrrhiza glabra L.). مجله­ی داروهای گیاهی 2: 13-7.

شاکری، ف.، بانی­نسب، ب.، قبادی، س. و مبلی، م. (1388). اثر غلظت و روش استفاده از پاکلوبوترازول بر رشد رویشی و زایشی توت­فرنگی رقم سلوا (Fragaria × ananassa Duch. cv. Selva). فصلنامه علوم باغبانی (علوم و صنایع کشاورزی. 23: 24-18.

کاری دولت­آبادی، ح.، محمدی گل­تپه، ا.، معینی، ا. و ورما، آ. (1391) ارزیابی تأثیر غلظت های مختلف اکسین و قارچ های Piriformospora indica و Sebacina vermifera روی نعناع فلفلی (Mentha piperita) و آویشن
 (Thymus vulgaris) در شرایط درون شیشه­ای. فصلنامه گیاهان دارویی 2:22-13.

کاظمی­شاهاندشتی، ص. معالی­امیری، ر. زینالی­خانقاه، . (1390) بررسی برخی شاخصهای خسارت سلولی تحت تنش سرما در نخود جم. فصلنامه ژنتیک نوین. 4. 77-70.

کافی، م.، برزویی، ا.، صالحی، م.، کمندی، ع.، معصومی، ع. و نباتی، ج. (1388) فیزیولوژی تنش­های محیطی در گیاهان. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. 502 صفحه.

 کافی، م. مهدوی­دامغانی، ع. (1386) مکانیسم­های مقاومت گیاهان به تنش­های محیطی. ترجمه. انتشارات دانشگاه مشهد. 467 صفحه.

محسن­زاده، س.، کریمی­اندانی، ج. و محبت­کار، حسن. (1389) مطالعه پاسخ­های فیزیولوژیکی و توالی یکی از ژن پاسخ دهنده به تنش سرما در چهار رقم گندم حساس و مقاوم. مجله علوم گیاهان زراعی ایران 41: 621-613.

ونایی، س.، سی­و ­سه مرده، ع. و حیدری، غ. 1390. اثرات تنش سرما در مرحله جوانه­زنی و گیاهچه­ای بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان و برخی صفات فیزیولوژیکی در نخود (Cicer arietinum L.). فصلنامه پژوهش­های زراعی ایران 9: 524-514.

Adya, A. K., Gautam, A., Zhang, L. and Varma, A. (2013) Characterization of Piriformospora indica Culture Filtrate. Piriformospora indica. Soil Biology 33: 345-375.

Auge, R. M., Stodola, A. J. W., Tims, J. E. and Saxton, A. M. (2001) Moisture retention properties of a mycorrhizal soil.  Journal of Plant and Soil. 230: 87-97.

Aebi, H. (1984) Catalase in vitro. Method of Enzymology 105:121-126.

Bradford, M. M. (1976) A Rapid and sensitive method for the quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Methods of Biochemical Analysis 72:248-254.

Baltruschat, H., Fodor, J., Harrach, B. D., Niemczyk, E., Barna, B., Gullner, G., Janeczko, A., Kogel, K. H., Schäfer, P., and Schwarczinger, I. )2008( Salt tolerance of barley induced by the root endophyte Piriformospora indica is associated with a strong increase in antioxidants. Journal New Phytologist 180: 501–510.

Baninasab, B. )2009( Amelioration of chilling stress by Paclobutrazol in watermelon seedlings. Journal of Scientia Horticultura 121: 144–148.

Bearden, B. N. )2001( Influence of arbuscular mycorrhizal fungi on soil structure and soil water characteristics of vertisols. Plant and Soil 229: 245-258.

Blee K. A., and Anderson, A. J. )1996( Defense-Related transcript accumulation in Phaseolus vulgaris L. colonized by the  arbuscular  mycorrhizal fungus glomus intraradices  Schenck & Smith. Journal of Plant Physiology 110: 675-688.

Cao, S., Bian, X., and Jiang, S. (2010) Cold treatment enhances lead resistance in Arabidopsis. Acta Physiologiae Plantarum 32: 19-25.

Davis, T. D., and Curry, E. A. (1991) Chemical regulation of vegetative growth. Critical Reviews in Plant Science 10: 151–188.

Deshmukh, S., R. Huckelhoven, P. Schafer, J. Imani, M. Sharma, M. Weiss, F. Waller, and K. H. Kogel. (2006) The root endophytic fungus Piriformospora indica requires host cell death for proliferation during mutualistic symbiosis with barley. Proceedings of the National Academy of Sciences 103:18450-18457.

Druege, U., Baltruschat, H., and Franken, P. (2007) Piriformospora indica promotes adventitious root formation in cuttings. Journal of Scientia Horticulturae. 112: 422-426.

Foyer, C. F., and Nector, G. (2000) Oxygen processing in photosynthesis regulation and signaling. New Phytologist 46: 359-388.

Foyer, C. H., Lelandais, M., and Kunert, K. J. (1994) Photooxidative stress in plants. Journal of Physiologia Plantarum 92: 696-717.

Irigoyen, J. J., Fmerrich, D. W., and Sanchez-Diaz, M. (1992) Water stress induced changes in concentrations  of proline and total soluble sugars in nodulated alfalfa plant. Physiol pland. 84:55-60.

Jan, N., ul-Hussain, M., I. and Andrabi, KH. (2009) Cold resistance in plants: A mystery unresolved. Electronic Journal of Biotechnology 12: 1-15.

Jubany-Mari, T., Prinsen, E., Munne-Bosch, S., and Alerge, L. (2010) The timing of methyl jasmonat, hydrogen peroxide and ascorbate accululation during water deficit and subsequentrecovery in the Meditrranean shrub Cistus albidus L. Journal of  Environmental and Experimental Botany 69:47-55.

Kaefer, E. (1977) Meiotic mitotic recombination in Aspergillus and its chromosomal aberration. Advances in Genetics 19: 33-131.

Khalid, K. A. (2006) Influence of water stress on growth, essential oil and chemical composition of herbs (Ocimum sp.). International Agrophysics 20: 289- 296.

Knight, H. and Knight, M. R. (2001) Abiotic stress signaling pathways: specificity and cross-talk.  Journal of Trends Plant Science 6: 262-267.

Kumar, M., Sharma, R., Jogawat, A., Singh, P., Dua, M., Gill, S.S., Trivedi, D. K., Tuteja, N., Varma, A. K., Oelmueller, R., and Johri, A. K. (2012) Piriformospora indica a root endophytic fungus, enhances abiotic stress tolerance of the host plant. Improving Crop Resistance to Abiotic Stress. 1 and 2: 543-548.

Kumar, M., Yadav, V., Tuteja, N., and Johri, AK. (2009) Antioxidant enzyme activities in maize plants colonized with Piriformospora indica. Microbiology. 155: 780–790.

Kumari, R., H. Kishan, Y. K. Bhoon and A. Varma, (2003) Colonization of cruciferous plants by Piriformospopra indica. Current Science 85:
1672-1674.

Lin, K. H. R., Tsou, C. C., Hwang, S. Y., Chen, and L. F. O., Lo, H. F. (2006) Paclobutrazol pre-treatment enhanced flooding tolerance of sweet potato. Journal of Plant Physiology 163:750-760.

Modarresi, M., G. Nematzadeh, F. Moradian and S. M. Alavi. (2012) Identification and Cloning of the Cu/Zn Superoxide Dismutase Gene from Halophyte Plant Aeluropus littoralis. Russian Journal of Genetics 48: 130-134.

Pan, Y., Jun, W. L. and Liang. Y. Z. (2006) Effect of salt and drought stress on antioxidant enzyme activities and SOD isoenzymes of liquorice (Glycyrrhiza uralensis Fisch). Plant Growth Regulation 49: 157-165.

Pinhero, R., and Fletcher, R. (1994) Paclobutrazol and ancymidol protect corn seedlings from high and low temperature stresses. Plant Growth Regulation 15: 47–53.

Rai, M., D. Achaya, A. Singh and Varma, A. (2001) Positive growth responses of the medicinal plants Spilanthes calva and Withania somnifera to inoculation by Piriformospora indica in a field trial. 2001. Mycorrhiza 11: 123-128.

Rai, M. and Varma, A. (2005) Arbuscular mycorrhiza-like biotechnological potential of Piriformospora indica, which promotes the growth of Adhatoda vasica. Electronic Journal of Biotechnology 8: 107-111.

Sankar, B., Jaleel, C. A., Manivannan, P., Kishorekumar, A., Somasundaram, R. and Panneerselvam, R. (2007) Drought-induced biochemical modifications and proline metabolism in Abelmoschus esculentus (L.) Moench. Acta Botanica Croatica 66: 43–56.

Seckin, B., Turkan, I., Sekmen, A. H., and Ozfidan, C. (2010) The role of antioxidant defense systems at differential salt tolerance of Hordeum marinum Huds. (sea barley grass) and Hordeum vulgare L. (cultivated barley).Journal of  Environmental and Experimental Botany 69: 76-85.

Sairam, R. K., Veerabhadra Rao, K., Srivastava, G. C. (2002) Differential response of wheat genotypes to long term salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Journal of Plant Science 163: 1037-1046.

Sun, Ch., Johnson, J. M., Cai, D., Sherameti, I., Oelmüller, R., and Lou, B. (2010) Piriformospora indica cofers drought tolerance in Chinese cabbage leaves by stimulating antioxidant enzymes, the expression of drought-related genes and the plastid-localized CAS protein. Journal of Plant Physiology 167: 1009-1017.

Tang, W., Newton, R. J. (2005) Peroxidase and catalase activities are involved in direct adventitious shoot formation induced by thidiazuron in eastern white pine (Pinus strobus L.) zygotic embryos. Journal of Plant Physiology and Biochemistry 43:730-769.

Tobeh, A., and Jamaati-e-Somarin, SH. (2012) Low temperature stress effect on wheat cultivars germination. African Journal of Microbiology Research 6: 1265-1269.

Varma, A., Kost, G., and Oelmüller, R. (2013) Priformospora indica. Sebacinales and Their Biotechnological Applications Series: Soil Biology 33: 397 pp.

Verma, S., A. Varma, KH. Rexer, G. Kost, A. Sarbhoy, P. Bisen, B. Butehorn, Franken. P. (1998) Piriformospora indica, gen. et sp. nov., a new root-colonizing fungus. Mycologia 95:896–903.

Waller, F., B. Achatz, H. Baltruschat, J. Fodor, K. Becker, M. Fischer, T. Heier, R. Huckelhoven, C. Neumann, D. Wettstein, P. Franken, and K. Kogel. (2005) The endophytic fungus Piriformospora indica reprograms barley to salt- stress tolerance, disease resistance, and higher yield. In: Proceedings of the National Academy of Sciences 103: 18450-18457.

Xing, L. and Zhu, J. H. (2002) Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress. Plant Cell and Environment 25: 131-139.

Yeshitela T., Robbertse P. J. and Stassen P. J. C. (2004) Paclobutrazol suppressed vegetative growth and improved yield as well as fruit quality of ‘Tommy Atkins’ mango (Mangifera indica) in Ethiopia. New Zealand Journal of Crop Horticulture Science 32: 281-293.

Young, R. S. (1983) Peach growth response from PP333 (Paclobutrazol). Plant Growth Regulation Society America 10: 192-194.

Zhu, Z. Liang, Z. and Han, R. (2009) Saikosapnin accumulation and antioxidative protectionin drought-stressed Bupleurum chinense DC. Plants. Environtal and Experimental Botany 66: 326-333.